滇黃精炭疽病病原分離鑒定及10 種植物源化合物的抑菌效果評價

竇 敏, 夏 燕, 鄒越紀(jì), 魯茸格丁, 李迎賓,2,王海寧, 朱書生, 張治萍*,,3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)藥系，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院 園藝系，昆明 650201)

0 引言

黃精為百合科、黃精屬藥用植物，主要分布在中國、朝鮮、蒙古等地，適宜生長在土質(zhì)疏松、肥沃的地區(qū)[1]。黃精的種類繁多，目前記載的有 70 多種，其中滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.是《中華人民共和國藥典》中記載的3 個中藥黃精基源植物 (滇黃精P.kingianum、黃精P.sibiricumRed.和多花黃精P.cyrtonemaHua.) 之一，具有較高的藥用價值[1-3]。近年來，隨著云南省林下中藥材產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，對滇黃精種苗的需求量不斷增加，然而，炭疽病已成為限制其種苗安全生產(chǎn)的重要因素之一[4]。炭疽菌種類復(fù)雜多樣，已報道的就有 600 多種[5]，如膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、尖胞炭疽菌C.acutatum、博寧炭疽菌C.boninense等[6-7]。此外，炭疽菌寄主廣泛，可侵染危害多種谷物、蔬菜、花卉、中藥材、果樹及林木等[8-10]。

炭疽菌作為龐大的復(fù)合種，分類鑒定相對復(fù)雜，目前通常采用形態(tài)學(xué)、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析及與致病性測定相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)主要通過菌落形態(tài)和生長速率、分生孢子形態(tài)和大小、附著胞形態(tài)和大小等特征進(jìn)行鑒定。由于炭疽菌種群復(fù)雜，且菌株在不同培養(yǎng)條件下形態(tài)學(xué)特征變化較大，因此，還需進(jìn)一步結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對菌株進(jìn)行鑒定，其系統(tǒng)發(fā)育分析?；贗TS(internal transcribed spacer)、ACT(actin)、CAL(calmodulin)、CHS-1(chitin synthase-1)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 和TUB2(β-tubulin 2) 等基因序列進(jìn)行[11]。

2019 至2022 年，本研究團(tuán)隊(duì)通過對云南省昆明市尋甸縣滇黃精育苗基地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其炭疽病發(fā)病率超過了 50%，嚴(yán)重區(qū)域甚至高達(dá) 90%～100%，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)氐狳S精種苗的培育。目前，針對炭疽菌常采用化學(xué)、物理、生物等防控手段，其中化學(xué)防治是最有效的方法之一。然而，化學(xué)藥劑的過量投入，不僅易造成環(huán)境污染，還可能使病原菌產(chǎn)生抗藥性，影響藥劑施用效果[12]。近年來，隨著人們對植物源化合物生物活性、使用方法和作用機(jī)理的深入探究，發(fā)現(xiàn)一些天然的植物源化合物可替代化學(xué)藥劑用于防控植物病害。例如，萜烯類化合物(R)-樟腦、(R)-香芹酮、(S)-檸檬烯等對鐮刀菌、黑曲霉有較好的抑制活性[13]，香芹酚能有效抑制番木瓜炭疽病菌[14]等，但尚未見關(guān)于植物源化合物在黃精炭疽病防治方面的研究報道。因此，篩選對滇黃精炭疽病病原菌具有活性的植物源化合物至關(guān)重要。

基于此，本研究首先對引起滇黃精種苗炭疽病的病原菌進(jìn)行了分離與鑒定，并進(jìn)一步采用平板熏蒸法或帶藥平板法，篩選對該病原菌具有抑制活性的植物源化合物，以期為滇黃精的有機(jī)種植及其病害綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品采集 從 2019—2022 年，于云南省昆明市尋甸縣滇黃精育苗基地采集疑似感染炭疽病的滇黃精種苗樣品12 份。

1.1.2 供試植物源化合物 見表1。純度 ≥ 95%，均購自上海源葉生物科技有限公司。

表1 供試植物源化合物Table 1 Plant-derived compounds used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA) 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，瓊脂 15 g，葡萄糖 20 g，用蒸餾水定容至 1 L[15]，121 ℃ 滅菌 20 min，備用。

1.1.4 其他供試材料 Biomed Fungi Genomic DNA Extraction Kit 試劑盒，北京博邁德基因技術(shù)有限公司；2 × Power Taq PCR masterMix，北京擎科生物科技有限公司；引物 (表2) 合成，北京擎科生物科技有限公司。

表2 滇黃精炭疽病病原菌鑒定所用引物序列Table 2 Primers for identification of pathogens causing anthracnose of Polygonatum kingianum

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原物分離純化 采用組織分離法[16]進(jìn)行病原菌分離：用無菌手術(shù)刀將病健交界處切成0.5 cm × 0.5 cm 的小塊，經(jīng)75% 的酒精消毒1 min，滅菌水清洗 2～3 次，充分晾干；將上述準(zhǔn)備好的植物組織接種于 PDA 培養(yǎng)基上，于27 ℃培養(yǎng) 3～5 d，待長出菌落后進(jìn)行菌株的分離純化。進(jìn)一步采用單孢分離法[3]純化分離物，于4 ℃ 冰箱保存，備用。

1.2.2 病原物形態(tài)學(xué)觀察 將分離物置于 PDA 培養(yǎng)基中，恒溫 27 ℃ 培養(yǎng) 7 d，觀察菌落形態(tài)和顏色等形態(tài)特征；隨后在培養(yǎng)基中加入適量滅菌水洗脫菌絲體和孢子，經(jīng)3 層紗布過濾后，通過光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄分生孢子和附著胞的形態(tài)特征及大小[15-16]。其中，分生孢子觀察 100 個，附著胞觀察 50 個，測量記錄并統(tǒng)計其長和寬。

1.2.3 DNA 提取及分子鑒定 刮取在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d 的菌絲，采用Biomed Fungi Genomic DNA Extraction Kit 試劑盒提取真菌基因組 DNA，利用ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH及TUB2基因的引物 (表2) 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 體系為25 μL：模板 DNA 4 μL (150 ng/mL)，2 × Power Taq PCR masterMix 12.5 μL，上、下引物各 1 μL(10 μmol/L)，以滅菌 ddH2O 補(bǔ)足 25 μL。以ddH2O 替代模板 DNA 作為陰性對照。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃ 變性10 s，退火溫度和 72 ℃ 延伸時間見表2，35 次循環(huán)；最后于 72 ℃ 延伸 2 min；4 ℃ 保存。所得PCR 原液送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測序，將測得的序列在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 中進(jìn)行BLAST 序列比對，下載相似性高的序列及其相應(yīng)的模式菌株序列 (表3)，按照ITS-ACT-CAL-CHS-1-GAPDH-TUB的順序進(jìn)行串聯(lián)，借助 MEGA 11 軟件，采用鄰接法 (Neighbor Joining) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展次數(shù) (bootstrap) 1000。

1.2.4 柯赫氏法則驗(yàn)證 選擇 2 株代表性菌株進(jìn)行致病性測定，每個菌株分別接種 3 株健康的一年生滇黃精種苗。具體步驟為：將分離物在PDA 平板上培養(yǎng) 7 d 后，用直徑 6 mm 的滅菌打孔器于菌落邊緣生長旺盛區(qū)域打取菌餅，待用；創(chuàng)傷黃精種苗葉片后接種菌餅，使菌絲與傷口完全貼合，以接種無菌 PDA 培養(yǎng)基的葉片作為空白對照；置于27 ℃ 培養(yǎng)間保濕培養(yǎng)，10 d 后觀察記錄發(fā)病情況，確定是否與田間病害癥狀一致。從發(fā)病部位再分離病原菌，采用 1.2.2 節(jié)和 1.2.3 節(jié)方法鑒定分離物的菌落及孢子形態(tài)等特征，并與接種菌株進(jìn)行比較[15-16]。

1.2.5 抑菌活性測定 將病原菌接種于 PDA 培養(yǎng)基中，恒溫 27 ℃ 培養(yǎng) 5 d 后，于菌落邊緣生長旺盛區(qū)域打取直徑 6 mm 的菌餅，待用。將粉末狀植物源化合物 (大黃素甲醚、小檗堿、黃藤素及蛇床子素) 分別采用相應(yīng)溶劑 (表1) 溶解，配制成1 ×107μg/L 的母液，采用孔徑 0.22 μm 的無菌濾膜將母液與液體植物源化合物分別過濾除菌后備用。

平板熏蒸法：將菌絲塊接種于 PDA 培養(yǎng)基平板中央；取直徑 1 cm 的無菌蓋子，置于 PDA 培養(yǎng)皿蓋中央，使其與菌絲塊處于同一垂直線上，倒置平板；在所放置的 1 cm 無菌蓋子里滴加不同體積的植物源化合物母液，使?jié)舛冗_(dá)到計算設(shè)定值，每個濃度處理重復(fù) 3 次。4-松油醇供試終濃度為0、25、50、70、100 和 150 μL/L；D-(+)-樟腦為0、20、40、60、80 和 100 μL/L；α-松油醇為0、25、50、70、100 和 150 μL/L；香芹酚為0、50、70、100、120 和 150 μL/L；其余液體植物源化合物供試終濃度為0、25、50、100、150和 200 μL/L。

帶藥平板法：分別取不同體積的植物源化合物母液與15 mL 已滅菌的 PDA 培養(yǎng)基混勻，制成不同濃度的帶藥培養(yǎng)基，以加入相應(yīng)溶劑的 PDA平板作為對照；待平板冷凝后，將菌絲塊接種于帶藥平板中央，倒置平板，每濃度處理重復(fù) 3 次。粉末狀植物源化合物供試終濃度 (質(zhì)量濃度) 為0、25、50、100、150 和200 μg/L。

操作完成后，迅速用封口膜進(jìn)行封閉處理，恒溫 27 ℃ 培養(yǎng) 5 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算菌絲生長抑制率。以各組植物源化合物濃度對數(shù)為x軸、菌絲生長抑制率為y軸, 求出毒力回歸曲線方程、相關(guān)系數(shù)r和半數(shù)有效抑制濃度 (EC50)[17]。

式中：I為菌絲生長抑制率，%；Dt表示處理組菌落直徑，mm；D0表示對照組菌落直徑，mm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2019 和 SPSS 26.0 計算軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；通過單因素方差、Duncan 氏法和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性比較，P＜ 0.05 則表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

病原物侵染初期，滇黃精種苗葉片表面出現(xiàn)橢圓形或梭形病斑；隨著病情加重，黃褐色病斑逐漸擴(kuò)大，并在最外層出現(xiàn)黃色暈圈，病斑呈近似輪紋狀；發(fā)病嚴(yán)重的葉緣處，病斑呈近半圓形或不規(guī)則形狀，或呈凹陷狀，葉片變薄，葉緣處破損 (圖1 A、B)。

圖1 滇黃精上果生炭疽菌的發(fā)病情況及形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Incidence and morphological characteristics of C. fructicola for P. kingianum

2.2 分離物形態(tài)學(xué)鑒定

針對采集到的 12 份病樣進(jìn)行病原菌的分離純化，共獲得 10 株疑似Colletotrichum菌株。將所得10 株菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d 后，所有菌株均表現(xiàn)出相同的形態(tài)學(xué)特征：菌落正面呈灰綠色，邊緣白色 (圖1 C)；菌落背面有灰褐色色素沉著，邊緣為黃白色 (圖1 D)。分生孢子為圓柱形，透明、無隔、壁光滑，兩端鈍圓至稍圓，大小為 (10.60～22.99) μm × (2.42～6.45) μm (平均值13.95 μm × 3.98 μm，n= 100) （圖1 E)；附著胞呈卵圓形、棕色至深棕色、頂端稍鈍，大小為 (4.71～10.04) μm × (3.17～6.33) μm (平均值 7.31 μm ×5.07 μm，n= 50) (圖1 F)。

2.3 病原菌多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

提取 DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用 1% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在 250～1000 bp 范圍內(nèi)均可看到單一、清晰、明亮的條帶 (圖2)。測序后經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，10 個分離物的ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、ITS及TUB2基因序列一致性均為100%。選擇其中代表性的分離物 HJ-35 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并將其擴(kuò)增獲得的 6 個基因序列上傳至NCBI，基因序列的 GenBank 登錄號依次為：LC494273.1 (ACT)、MF627920.1 (CAL)、LC494275.1 (CHS-1)、MT407955.1 (GAPDH)、MZ961711.1 (ITS) 和MZ852393.1 (TUB2)。在基于ITS-ACT-CAL-CHS-1-GAPDH-TUB多基因構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹中 (圖3)，菌株 HJ-35 與C.fructicola的自展值 (bootstrap) 為 100，表明 HJ-35 與C.fructicola的親緣關(guān)系最近，為同一種。

圖2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products

圖3 基于ITS-ACT-CAL-CHS-1-GAPDH-TUB 多基因序列聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree inferred from combined partial ITS-ACT-CAL-CHS-1-GAPDH-TUB sequences

綜合上述形態(tài)學(xué)和多基因序列分析，確定 HJ-35 菌株為果生炭疽菌C.fructicola。

2.4 分離物侵染能力

將單孢純化的代表性菌株 (HJ-35 和HJ-29) 接種至健康的一年生滇黃精種苗，其致病性測定結(jié)果顯示：接種葉片表現(xiàn)出與田間病害一致的癥狀，初期葉片正面出現(xiàn)黃褐色針尖大小的病斑，外圍呈現(xiàn)黃褐色輪狀暈圈；隨后病斑逐漸擴(kuò)大，外圍由黃褐色變?yōu)樯詈稚?；接種 10 d 后，病斑處葉片變薄，有的甚至出現(xiàn)穿孔，病斑長度為 0.9～1.2 cm (圖1 G)。將發(fā)病葉片再次進(jìn)行病原菌分離，所獲得的菌株其形態(tài)學(xué) (菌落形態(tài)、顏色，分生孢子及附著胞) 特征和分子生物學(xué)特征均與原接種菌株一致。

2.5 植物源化合物對果生炭疽菌的抑制活性

供試 10 種植物源化合物對果生炭疽菌的抑制活性測定結(jié)果顯示：α-松油醇、4-松油醇及香芹酚的抑制活性較為顯著，EC50值均低于 100 μL/L，其中α-松油醇的抑制效果最好(表4) ；而其余 7種供試植物源化合物的EC50值均大于 150 μL/L(數(shù)據(jù)未列出)。隨著藥劑濃度增加，α-松油醇、4-松油醇和香芹酚對果生炭疽菌菌絲生長的抑制效果均更加顯著，在 150 μL/L 時，3 種藥劑對果生炭疽菌菌絲生長的抑制率均高于 70%，其中 4-松油醇的抑制率超過 80% (圖4)。

圖4 不同濃度4-松油醇、α-松油醇及香芹酚對果生炭疽菌的抑制活性Fig.4 Inhibitory activities of different concentrations of 4-terpineol, α-terpineol, carvacrol against C. fructicola

表4 供試3 種植物源化合物對果生炭疽菌的抑制活性Table 4 Inhibitory activity of 3 plant-derived compounds on C. fructicola

3 結(jié)論與討論

本研究首次明確了云南省昆明市尋甸縣滇黃精種苗種植基地的滇黃精種苗炭疽病由果生炭疽菌C.fructicola引起。馬云云等[3]通過ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，炭疽菌屬真菌對多年生滇黃精植株具有危害；但雨柔等[16]采用ITS-ACT-CHS-TUB多基因系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，明確了多花黃精炭疽病由松針炭疽菌C.fioriniae和博寧炭疽菌C.boninense侵染引起。不同研究中分離得到不同種類的炭疽菌可能與寄主種類、寄主不同生長時期 (本研究為滇黃精種苗)、種植模式和種植區(qū)域有較大關(guān)系，不同的區(qū)域和種植模式不僅會影響植物的生長發(fā)育，還可能影響病原菌的生長和侵染能力。此外，由于炭疽菌種群龐大、種類多樣，而本研究中采集的樣本有限，因此在后續(xù)工作中可擴(kuò)大樣本采集地點(diǎn)和采集數(shù)量，進(jìn)一步明確為害云南省尋甸縣種植基地滇黃精的炭疽病菌種類，為黃精炭疽病的防控提供可靠依據(jù)。

炭疽菌作為世界十大危害嚴(yán)重的病原真菌之一[18]，具有廣泛的寄主侵染性。除侵染黃精外，中藥材人參[6]、鐵皮石斛[19]、云黃連[20]等亦可被炭疽病危害。炭疽病曾造成我國長白山地區(qū)林下參30% 的損失，造成日本和朝鮮林下參 50% 的損失，在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的人參幼苗上發(fā)病曾達(dá)到100%[21]。此外，炭疽菌還可侵染水果、花卉、蔬菜等多種經(jīng)濟(jì)作物并給當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成損失。例如，膠孢炭疽菌為害草莓，給草莓種植業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[22]；尖孢炭疽菌侵染枇杷，影響果實(shí)產(chǎn)量和質(zhì)量[23]；果生炭疽菌侵染柿子，影響果實(shí)品質(zhì)[24]；膠孢炭疽菌侵染玫瑰，引起植株枯萎死亡[25]；平頭炭疽菌C.truncatum侵染白菜種苗，導(dǎo)致白菜產(chǎn)量下降[26]等。這些研究進(jìn)一步說明，炭疽菌具有廣泛寄生性和嚴(yán)重危害性。目前通常采用化學(xué)藥劑防治炭疽病[27]，長期大量使用易造成環(huán)境污染、殘留風(fēng)險及耐藥性等問題，而大部分植物源化合物是天然殺菌劑，可在一定程度解決上述問題，提高農(nóng)產(chǎn)品食用安全保障[13]。因此，篩選安全有效的植物源化合物防控炭疽病具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，科研工作者們不斷發(fā)現(xiàn)和解析了多種植物源化合物的抑菌活性和機(jī)理：王江來等[17]發(fā)現(xiàn)香芹酚能有效抑制腐皮鐮刀菌Fusarium solani的生長；于婧[14]發(fā)現(xiàn)香芹酚可以抑制番木瓜炭疽菌C.okinawense的生長；元維軍等[28]發(fā)現(xiàn)0.8% 大黃素甲醚懸浮種衣劑對小麥紋枯病防治效果較好；周清等[29]的研究表明，大蒜素可抑制辣椒炭疽病菌C.capsici和辣椒疫病菌Phytophthora capsica菌絲的生長和孢子萌發(fā)；4-松油醇和α-松油醇可抑制念珠菌Candida strains的生長[30]等。然而，還鮮有植物源化合物防控果生炭疽菌的相關(guān)研究報道。本研究選擇 9 種已獲準(zhǔn)登記使用的植物源化合物和黃藤素 (表1)，采用平板熏蒸法或帶藥平板法進(jìn)行了抑菌活性評價，結(jié)果較為直觀。

本研究發(fā)現(xiàn)，α-松油醇、4-松油醇和香芹酚對果生炭疽菌的生長均具有較好的抑制作用，EC50值依次為 54.26、81.74 和94.78 μL/L，這不僅為滇黃精炭疽病的綠色防控提供了方向，同時還為拓寬植物源化合物的使用提供了理論依據(jù)。另外，本課題組在對云南省多個滇黃精種苗基地疑似炭疽病染病樣品的病原菌分離鑒定中，也明確了其致病菌為果生炭疽菌，后期我們將進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍，連續(xù)監(jiān)測果生炭疽菌的動態(tài)流行；同時，針對黃精炭疽病害的綠色防控，將繼續(xù)擴(kuò)大植物源化合物的篩選范圍，并結(jié)合田間試驗(yàn)對篩選獲得的植物源化合物進(jìn)行藥效評估，以期為生產(chǎn)中滇黃精炭疽病的綠色防控提供技術(shù)指導(dǎo)。