超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測人參制品中39 種農(nóng)藥殘留

岳偉芊, 張旭桐, 逯忠斌, 侯志廣, 李月茹, 逯 洲*,,

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部參茸產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室 (長春)，長春 130118 )

人參Panax ginsengC.A.Meyer 是五加科人參屬多年生草本植物，具有多種藥理活性[1-3]。人參制品是以人參為原料，經(jīng)過不同的工藝加工炮制而成的。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)以及加工工藝的進步，人參制品的種類大大增加，目前主要有生曬參、紅參、人參茶、人參蜜片、人參酒、人參口服液、紅參膏和人參糖等[4]。人參種植周期一般為4 至6 年，期間易發(fā)生多種病蟲害，所以農(nóng)藥的施用必不可少。長期用藥會導(dǎo)致農(nóng)藥的積累，這也使得人參制品中存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)的風(fēng)險。因此，需要建立適用于多種人參制品的農(nóng)藥多殘留檢測方法。目前對人參制品中農(nóng)藥多殘留檢測的研究主要集中于生曬參和紅參[5-9]，而有關(guān)人參蜜片、人參水煎液、人參功能飲料和人參酒中的農(nóng)藥殘留檢測則未見相關(guān)報道，并且國內(nèi)外均未對這4 種人參制品中農(nóng)藥的最大殘留限量 (MRL)作出規(guī)定。

QuEChERS (quick, easy, cheap, effective,rugged, and safe) 法是Anastassiades 等于2003 年提出的一種快速、有效的農(nóng)藥殘留樣品前處理方法，主要包括乙腈鹽析提取、分散固相萃取 (d-SPE) 凈化等過程[10]，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留檢測。為了提高凈化效果，減少基質(zhì)共萃物對分析結(jié)果的干擾，后續(xù)研究采用不同的凈化材料對QuEChERS 法進行改進。有報道指出，氧化鋯表面具有大量路易斯酸點位，可以吸附脂肪酸等路易斯堿，從而降低基質(zhì)對分析的干擾[11]。目前，基于氧化鋯 (ZrO2) 開發(fā)的新型材料如氧化鋯改性硅膠 (Z-Sep) 已經(jīng)成功應(yīng)用于多種食品的農(nóng)藥殘留分析[12-15]。與傳統(tǒng)的QuEChERS 法使用的d-SPE 凈化相比，新型的磁性固相分散萃取可以通過磁鐵快速分離提取液和凈化材料，省去了離心步驟，提高凈化的效率[16]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UHPLC-MS/MS) 法具有高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點，與高效液相色譜 (HPLC) 法相比，分析時間大大縮短，與氣相色譜 (GC) 以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS) 法相比，UHPLC-MS/MS不僅所需分析時間更短，而且可以檢測不易揮發(fā)的以及受熱易分解的化合物，現(xiàn)已成為農(nóng)藥殘留分析中最為重要的檢測手段之一[17-20]。

截至2022 年底，我國已經(jīng)在人參上登記了43 種農(nóng)藥有效成分[21]。其中，枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌等生物殺菌劑沒有規(guī)定MRL，一些無機殺菌劑如氫氧化銅和王銅不適用于色譜法分析。因此，本研究選擇其中23 種與UHPLCMS/MS 檢測適配的農(nóng)藥，并添加了16 種潛在用于人參種植的高效、低毒農(nóng)藥作為檢測對象，采用QuEChERS 法快速提取，將Fe3O4-ZrO2首次應(yīng)用于人參制品樣品的凈化，結(jié)合UHPLC-MS/MS建立了4 種人參制品中39 種農(nóng)藥殘留的檢測方法，并用所建立的方法對采集的人參制品樣品進行了篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30 超高效液相色譜儀 (日本Shimadzu 公司)；AB Sciex QTRAP4500 串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國SCIEX 公司)；Milli-Q 超純水儀 (美國Millipore 公司)；X1R 型離心機 (美國ThermoFisher 公司)；TECNAI F20 透射電子顯微鏡 (美國FEI 公司)。

唑菌酯標(biāo)準(zhǔn)品 (98.30%，天津阿爾塔科技有限公司)；烯酰嗎啉 (98.70%)、嘧菌酯 (99.50%)、雙炔菌酰胺 (99.40%)、咪鮮胺 (98.80%)、嘧霉胺(99.90%)、噻蟲啉 (99.68%)、乙霉威 (99.60%)、噻蟲嗪 (99.60%)、三唑酮 (98.70%)、腈菌唑 (99.90%)、嘧菌環(huán)胺 (99.90%)、氟吡菌胺 (99.30%)、肟菌酯(98.80%)、吡唑醚菌酯 (98.00%)、丙環(huán)唑 (99.00%)、三唑磷 (98.90%)、噻蟲胺 (99.12%)、溴氰蟲酰胺(98.20%)、仲丁靈 (98.70%)、霜靈 (97.60%)、胺苯吡菌酮 (99.60%)、氟唑菌酰胺 (99.00%)、苯醚甲環(huán)唑 (99.90%)、精喹禾靈 (99.00%)、精異丙甲草胺 (98.56%)、戊唑醇 (98.50%)、甲霜靈 (99.90%)、多菌靈 (98.60%)、四氯蟲酰胺 (98.00%)、霜霉威(98.20%)、氟硅唑 (98.00%)、氟吡菌酰胺 (99.70%)、氟嗎啉 (96.50%)、氯蟲苯甲酰胺 (97.80%)、異丙噻菌胺 (98.90%)、吡蟲啉 (99.00%)、氟啶胺 (99.90%)、咯菌腈 (99.80%) 標(biāo)準(zhǔn)品，均購自英國LGC 公司；Z-Sep 和甲酸銨 (99.995%) (美國Sigma 公司)；氧化鋯納米顆粒 (南京先豐納米材料科技有限公司)；ZrCl4和FeCl3? 6H2O (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；FeCl2? 4H2O (上海阿法埃莎化學(xué)有限公司)；乙腈 (色譜純，北京迪科馬科技有限公司)；氯化鈉和無水硫酸鎂 (廣東西隴科學(xué)股份有限公司)；氨水 (純度25.0%，北京化工廠)。4 種人參制品樣品購買自中國人參主產(chǎn)區(qū)吉林省的超市和藥材商店。

1.2 儀器條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex F5 色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；流動相A 為5 mmol/L的甲酸銨水溶液，流動相B 為乙腈。梯度洗脫程序：0 min，10% B；1.0 min，10% B；6.0 min，65% B；10.0 min，95% B；11.0 min，95% B；11.1 min，10% B；15.0 min，10% B。柱溫設(shè)置為40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子和負離子掃描模式 (ESI+/ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)；離子化電壓5500 V (ESI+)/-4500 V (ESI-)；離子源溫度550 ℃；氣簾氣241.3 kPa；噴霧氣和輔助加熱氣310.3 kPa。39 種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測參數(shù)如表1 所示。

表1 39 種農(nóng)藥的檢測參數(shù)Table 1 Detection parameters of 39 pesticides

1.3 樣品制備

1.3.1 Fe3O4-ZrO2的合成 在文獻方法[22]的基礎(chǔ)上合成Fe3O4-ZrO2：將1.585 g FeCl2? 4H2O、3.785 g FeCl3? 6H2O、2.500 g ZrCl4以及160 mL除氧水加入250 mL 三口燒瓶中，在氮氣保護條件下，80 ℃磁力攪拌1 h。隨后快速加入22.5 mL氨水，在相同條件下繼續(xù)攪拌1 h。冷卻至室溫后，用磁鐵收集產(chǎn)物并用超純水洗滌，直到pH 值達到7。最后，將產(chǎn)物置于80 ℃烘箱內(nèi)6 h，冷卻后研磨，保存在干燥器中待用。

1.3.2 人參制品樣品的前處理 將人參蜜片在80 ℃下烘干24 h，粉碎，稱取5 g (精確至0.01 g) 至50 mL離心管中，加入10 mL 超純水，渦旋混勻后浸泡30 min；人參功能飲料或人參水煎液量取10.0 mL，置于50 mL 離心管中。向離心管中加入10.0 mL乙腈，2500 r/min 渦旋1 min。隨后加入4 g 無水硫酸鎂和1 g 氯化鈉，渦旋1 min，5000 r/min離心5 min。取1 mL 上清液加入裝有凈化材料的2 mL 離心管 (人參蜜片和人參水煎液用100 mg Fe3O4-ZrO2凈化，人參功能飲料用25 mg Fe3O4-ZrO2凈化)，渦旋10 s，使用磁鐵磁力收集2 min。取上清液，過0.22 μm 濾膜后待測。

人參酒是有機相和水相的混合物。其中，有機相無法通過鹽析與乙腈分層，而水相會被凈化材料吸附導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，人參酒取1 mL 過0.22 μm 濾膜后直接上機，無需其他處理。

1.4 方法驗證

稱取39 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別加入10 mL乙腈溶解，配制成1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；使用39 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成20 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用乙腈或空白基質(zhì)提取液 (人參蜜片、人參水煎液和人參功能飲料) 以及人參酒的空白基質(zhì)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/L 的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用1.2 節(jié)中的條件檢測，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo) (y)，權(quán)重為1/x，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在0.01、0.1、1 μg/g 3 個添加水平下，對4 種人參制品空白樣品進行添加回收試驗，每個添加水平重復(fù)5 次。由于1 μg/g 添加水平下樣品中分析物的濃度超出了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，因此，使用空白人參制品提取物將該添加水平的樣品稀釋10 倍以達到范圍內(nèi)濃度。采用1.3.2節(jié)中的方法處理樣品，在1.2 節(jié)的條件下檢測，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

基質(zhì)效應(yīng) (ME) 是由基質(zhì)共萃物離子化引起的，是UHPLC-MS/MS 分析中影響方法準(zhǔn)確度、精密度的重要因素之一。按 (1) 式計算ME。

式中Sm為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，Ss為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME > 20% 時為基質(zhì)增強效應(yīng)，-20% ≤ ME ≤ 20%時基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當(dāng)ME ＜-20%時為基質(zhì)抑制效應(yīng)[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用針泵在10 μL/min 流速下將1.0 mg/L 的39 種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入質(zhì)譜，得到每個化合物的母離子以及兩個特征定性子離子，以響應(yīng)最高的子離子作為定量離子。分別優(yōu)化去簇電壓 (DP) 和碰撞能 (CE)，以提高母離子與子離子的響應(yīng)。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的優(yōu)化 Lehotay 等在對QuEChERS

法進行驗證的過程中發(fā)現(xiàn)，在非酸性基質(zhì)中，一些對堿性pH 敏感的農(nóng)藥回收率較低[24]。為解決此問題，Anastassiades 等又開發(fā)了檸檬酸鹽緩沖體系將基質(zhì)的pH 值調(diào)節(jié)至弱酸性，使對堿性pH 敏感的農(nóng)藥的回收率提高到70%以上[25]。本研究對比了非緩沖QuEChERS 法和檸檬酸鹽緩沖QuEChERS法對人參蜜片、人參水煎液以及人參功能飲料中39 種農(nóng)藥提取回收率的影響，結(jié)果 (圖1) 表明：采用無緩沖QuEChERS 法提取人參蜜片、人參水煎液以及人參功能飲料中39 種農(nóng)藥的回收率分別為73%～101%、75%～109%和74%～94%，RSD 分別為1.5%～12%、2.4%～16%和1.4%～15%；而采用檸檬酸鹽緩沖QuEChERS 法提取，相應(yīng)的農(nóng)藥回收率分別為78%～109%、80%～99% 和71%～91%，RSD 分別為1.8%～14%、1.5%～13% 和0.8%～17%。兩種方法均滿足農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)的要求 (回收率為70%～120%，RSD ≤ 20%)[26]，這可能是由于本方法中包含的農(nóng)藥對提取環(huán)境酸堿度不敏感造成的。因此，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，本研究選用無緩沖QuEChERS 法作為提取方法。

圖1 不同提取方式從人參水煎液、人參功能飲料、人參蜜片和人參酒中提取39 種農(nóng)藥的回收率(n = 5)Fig.1 Recoveries (n = 5) of 39 pesticides from ginseng decoction, ginseng energy drink, honey ginseng slices and ginseng wine extracted by different methods

2.2.2 凈化材料的優(yōu)化 對合成的產(chǎn)物使用透射電子顯微鏡 (TEM) 和能量色散X 射線衍射 (EDX)進行表征，結(jié)果如圖2 所示。圖2(a)顯示制備的產(chǎn)物呈顆粒狀，圖2(b)顯示產(chǎn)物中含有Fe、O 和Zr，經(jīng)過測試，所制備的產(chǎn)物具有磁性，上述結(jié)果 (圖2) 表明本研究成功合成了Fe3O4-ZrO2。

圖2 Fe3O4-ZrO2 的表征：(a) 透射電子顯微鏡圖像，(b) 能量色散X 射線衍射圖像Fig.2 Characterizations of Fe3O4-ZrO2: (a) transmission electron microscope (TEM) image,(b) energy-dispersive X-ray diffraction (EDX) image

ZrO2中的鋯原子含有空的d 軌道，可以作為電子受體吸附脂肪酸和氨基酸等化合物[17,25]。Z-Sep已經(jīng)作為凈化材料廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析。因此，本研究選取了3 種ZrO2材料 (ZrO2納米顆粒、Z-Sep、Fe3O4-ZrO2) 并對比分析了它們在25、50 和100 mg 3 種用量下的回收率和凈化效果。

不同用量下使用Z-Sep 凈化人參蜜片、人參水煎液和人參功能飲料提取液，39 種農(nóng)藥在人參蜜片中的回收率分別為63%～93%、69%～90%和72%～95%，在人參水煎液中分別為54%～92%、59%～97%和63%～97%，在人參功能飲料中分別為45%～97%、45%～89%和52%～96%。不同用量下使用ZrO2納米顆粒凈化3 種基質(zhì)，在人參蜜片中的回收率分別為71%～103%、79%～97% 和77%～93%，在人參水煎液中分別為61%～91%、73%～96%和75%～97%，在人參功能飲料中分別為74%～98%、70%～92%和80%～98%。除霜霉威以外，其余農(nóng)藥回收率均在70%～120%之間。不同用量下使用Fe3O4-ZrO2凈化3 種樣品，在人參蜜片中的回收率分別為78%～97%、72%～95%和78%～98%，在人參水煎液中分別為71%～96%、72%～93%和77%～95%，人參功能飲料中分別為76%～108%、74%～98%和77%～95%。所有凈化材料都提供了良好的回收率。

在獲得良好回收率的同時，凈化材料應(yīng)盡可能多的去除基質(zhì)共萃物。本研究通過高效液相色譜法對比了3 種空白人參制品在不同凈化條件下的基質(zhì)背景。如圖3 所示，在相同用量下Fe3O4-ZrO2最大程度地降低了基質(zhì)背景，對人參水煎液和人參蜜片的凈化效果最好，而3 種材料對人參功能飲料的凈化效果基本相同，這是因為人參功能飲料中添加的人參成分較少。由于磁性材料的成本優(yōu)勢及快速凈化能力，選用Fe3O4-ZrO2凈化人參功能飲料。如圖4 所示，100 mg Fe3O4-ZrO2對基質(zhì)背景的去除效果最佳，對人參水煎液和人參蜜片的凈化效果最好，而3 種用量對人參功能飲料的凈化效果基本相同。ZrO2材料對人參制品提取液的凈化能力一方面來自于鋯原子上的路易斯酸點位對脂肪酸、氨基酸等路易斯堿的吸附，另一方面可能是因為鋯原子與含有羥基、羧基等基團的人參皂苷、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)等化合物形成氫鍵而產(chǎn)生的吸附。3 種ZrO2材料的凈化效果不同，可能是因為相同質(zhì)量下不同材料中鋯含量不同所造成的。綜上所述，本研究選用100 mg Fe3O4-ZrO2作為人參蜜片和人參水煎液的凈化材料，選用25 mg Fe3O4-ZrO2作為人參功能飲料的凈化材料。

圖3 使用相同用量的不同ZrO2 基材料凈化人參水煎液、人參功能飲料和人參蜜片后的基質(zhì)背景Fig.3 Matrix background of ginseng decoction, ginseng energy drink and honey ginseng slices that cleaned-up by different ZrO2-based sorbents at the same dosage

圖4 使用不同用量的Fe3O4-ZrO2 凈化人參水煎液、人參功能飲料和人參蜜片后的基質(zhì)背景Fig.4 Matrix background of ginseng decoction, ginseng energy drink and honey ginseng slices that cleaned-up by different amounts of Fe3O4-ZrO2

2.3 方法評價

2.3.1 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng) 39 種農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù) (r) 以及基質(zhì)效應(yīng)如表2 所示，在0.005～0.1 mg/L 的濃度范圍內(nèi)，39 種化合物在4 種人參制品中的線性良好，r大于0.99。在人參蜜片、人參功能飲料、人參水煎液和人參酒中分別有72%、36%、8%以及31%的農(nóng)藥存在基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)，因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。

表2 39 種農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Equations, correlation coefficient (r) and matrix effects (MEs) of 39 pesticides in different matrices

2.3.2 添加回收率和定量限 添加回收試驗結(jié)果如表3 所示，在0.01、0.1、1 mg/kg 3 個添加水平下，39 種農(nóng)藥在人參蜜片中的平均回收率為72%～117%，RSD 為0.7%～18%；在人參水煎液中的平均回收率為77%～115%，RSD 為0.7%～15%；在人參功能飲料中的平均回收率為74%～104%，RSD 為0.6%～16%；在人參酒中的平均回收率為77%～104%，RSD 為1.0%～16%。本研究以最低添加水平作為方法的定量限 (LOQ)，4 種人參制品基質(zhì)中39 種農(nóng)藥的LOQ 均為0.01 mg/kg。39 種農(nóng)藥的典型MRM 色譜圖如圖5所示。

圖5 0.01 mg/kg 添加水平下人參蜜片中39 種農(nóng)藥的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of the 39 pesticides at spiking level of 0.01 mg/kg in honey ginseng slices

表3 39 種農(nóng)藥在4 種人參制品中的平均回收率(Rec.)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 39 pesticides in 4 ginseng products

2.4 實際樣品檢測

用建立的方法對吉林省市場上采集的人參蜜片 (n= 20)、人參水煎液 (n= 20)、人參功能飲料(n= 20) 及人參酒 (n= 20) 進行檢測，結(jié)果表明，在所有樣品中均未檢出方法中所含農(nóng)藥的殘留。

3 結(jié)論

本研究建立了通過UHPLC-MS/MS 快速檢測4 種人參制品中39 種農(nóng)藥殘留的方法。該方法通過QuChERS 法提取，F(xiàn)e3O4-ZrO2快速凈化。經(jīng)驗證，F(xiàn)e3O4-ZrO2對樣品的凈化效果比ZrO2納米顆粒和Z-Sep 更好，方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求。該方法具有高通量、凈化效果好且操作簡便的特點，可作為相關(guān)農(nóng)藥風(fēng)險篩查的技術(shù)依據(jù)。