河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺及其復(fù)配劑的敏感性

苗淑斐, 李路怡, 錢 樂, 徐建強(qiáng), 姜 佳, 劉圣明

(河南科技大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院 植物保護(hù)系，河南 洛陽(yáng) 471023)

由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum引起的菌核病是油菜生產(chǎn)上的重要病害，在我國(guó)各地區(qū)均有發(fā)生，以長(zhǎng)江中下游和東南沿海最為嚴(yán)重，發(fā)病率在10%～80%之間，產(chǎn)量損失在5%～30%之間[1-2]。菌核病在油菜幼苗至成株期間均可發(fā)生，其中在花期發(fā)生較為嚴(yán)重，可危害植株上部各部位，尤以莖稈受害最嚴(yán)重[3-5]。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)高抗菌核病的油菜品種，每年都會(huì)因菌核病而遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。油菜菌核病在生產(chǎn)中的防治主要采用在油菜主莖開花95%時(shí)，噴施苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈和三唑類殺菌劑戊唑醇等化學(xué)藥劑[8-11]，但是由于長(zhǎng)期使用單一化學(xué)藥劑，容易導(dǎo)致病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，使其田間防治效果下降[12-13]。因此，迫切需要不同作用機(jī)制的新型殺菌劑用來防控油菜菌核病。

氟吡菌酰胺 (fluopyram) 是拜耳作物科學(xué)公司開發(fā)的一種吡啶-乙基-苯甲酰胺琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHI) 殺菌劑，2009 年上市，具有廣泛的殺菌譜，對(duì)菌核病菌、灰霉病菌、白粉病菌和靶斑病菌等多種病原真菌具有較好的抑菌活性[14-15]。而2010 年至今，氟吡菌酰胺在我國(guó)僅登記用于黃瓜等作物白粉病、灰霉病、靶斑病和根結(jié)線蟲的防治。目前，其尚未在油菜上獲得登記 (http://www.chinapesticide.org.cn/)，關(guān)于河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性也未見報(bào)道。因此，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了2015 年和2016 年從河南省5 個(gè)地市采集的127 株油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性，建立了油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性基線；同時(shí)，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈6 種殺菌劑及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌的聯(lián)合毒力，旨在為河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的抗藥性監(jiān)測(cè)和油菜菌核病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 2015—2016 年從河南省平頂山、漯河、周口、鄭州和駐馬店5 個(gè)地市采集并單菌核分離得到127 株油菜菌核病菌菌株，由河南科技大學(xué)殺菌劑生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試藥劑 供試殺菌劑均為原藥，96%氟吡菌酰胺 (fluopyram)，拜耳作物科學(xué) (中國(guó)) 有限公司；97%丙硫菌唑 (prothioconazole)，山東海利爾化工有限公司；95%葉菌唑 (metconazole)，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司；98% 多菌靈(carbendazim)，江蘇龍燈化學(xué)有限公司；98%咯菌腈 (fludioxonil)，先正達(dá)農(nóng)作物保護(hù)股份公司；95%菌核凈 (dimethachlone)，江西禾益化工股份有限公司。將多菌靈原藥預(yù)溶于0.1 mol/L 稀鹽酸，氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、咯菌腈和菌核凈原藥分別預(yù)溶于丙酮，配制成至質(zhì)量濃度為104μg/mL 的母液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，蒸餾水1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[16]。將氟吡菌酰胺母液系列稀釋，按照一定的比例分別加入到經(jīng)滅菌熱熔冷卻至50～55 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成含氟吡菌酰胺0.0016、0.0063、0.025、0.10 和0.40 μg/mL系列質(zhì)量濃度的PDA 平板，以加入等體積丙酮、不加藥劑的PDA 平板作為對(duì)照。將供試菌株在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d，在菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，轉(zhuǎn)移至PDA 平板上。將PDA平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d，采用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑，記錄各菌落平均直徑。各處理3 次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。按公式 (1) 計(jì)算各濃度處理下藥劑對(duì)菌絲的生長(zhǎng)抑制率(I)[17]。

式中：Dck為對(duì)照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。利用DPS 軟件，通過抑制率幾率值 (y)與藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值 (x) 之間的線性回歸關(guān)系，求出毒力回歸方程、有效抑制中濃度(EC50值) 及相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 敏感性分布圖繪制 將供試的油菜菌核病菌群體對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性由高到低分成不同的區(qū)間，統(tǒng)計(jì)各菌株EC50值在每個(gè)區(qū)間的分布頻率 (%)。以EC50值的區(qū)間范圍為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)區(qū)間EC50值的頻率為縱坐標(biāo)，繪制油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性頻率分布圖，建立其敏感性基線。

1.2.3 殺菌劑單劑及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌對(duì)的毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[16]，測(cè)定氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈、菌核凈6 種單劑以及氟吡菌酰胺與其他5 種藥劑分別按照母液體積比為1 : 5、1 : 3、1 : 1、3 : 1、5 : 1 的復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌菌株ZZ1606 的毒力。將各單劑和復(fù)配劑進(jìn)行系列稀釋，按照一定的比例分別加入到經(jīng)滅菌熱熔后冷卻至50～55 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，制成含氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈、菌核凈單劑及其各復(fù)配劑系列質(zhì)量濃度的PDA 平板(表1)。以加入等體積對(duì)應(yīng)溶劑、不加藥劑的PDA 平板為對(duì)照。按照1.2.1 節(jié)敏感性測(cè)定和計(jì)算方法，求出各單劑及其復(fù)配劑的EC50值。利用公式 (2) 求出各復(fù)配劑理論抑制中濃度[EC50(Exp)]，利用公式 (3) 求出增效系數(shù) (SR) 值，當(dāng)SR 值大于1.5 時(shí)為增效作用，在0.5 和1.5 之間為相加作用，小于0.5 時(shí)為拮抗作用[18]。

表1 供試殺菌劑及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌毒力測(cè)定使用的濃度梯度Table 1 The concentration of the fungicide and their mixtures was used to determine the toxicity to Sclerotinia sclerotiorum

式中：A，B 為復(fù)配的藥劑；a，b為藥劑在配方中所占的比例；EC50(Exp)為理論抑制中濃度，μg/mL；EC50(Obs)為實(shí)際測(cè)量抑制中濃度，μg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析利用Excel 2013 和DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件，得出藥劑抑制菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50值，采用顯著性最小差異法 (Least-Significant Difference, LSD,P＜ 0.05) 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性

測(cè)定結(jié)果 (表2) 顯示：氟吡菌酰胺對(duì)河南省127 株油菜菌核病菌的EC50值范圍為0.0100～0.0989 μg/mL，平均值為 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL。不同地市間的菌株對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性差異不顯著：平均EC50值變化范圍在 (0.0482 ± 0.0240)～(0.0609 ± 0.0138) μg/mL 之間，其中從鄭州分離鑒定到的菌株對(duì)氟吡菌酰胺最敏感，從駐馬店分離鑒定到的菌株對(duì)氟吡菌酰胺最不敏感。氟吡菌酰胺對(duì)各市菌株的平均EC50值與其對(duì)127 株菌株的平均EC50值無顯著差異。

表2 2015—2016 年河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性Table 2 The sensitivity of S. sclerotiorum to fluopyram in Henan Province from 2015 to 2016

2.2 油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性基線分析

從頻率分布直方圖可以看出，供試油菜菌核病菌菌株對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性呈連續(xù)單峰曲線(圖1)，EC50最大值為最小值的9.89 倍，70%以上菌株的EC50值小于0.07 μg/mL，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體，表明氟吡菌酰胺對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，可將 (0.0546 ±0.0228) μg/mL 作為河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性基線。

圖1 河南省127 株油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的EC50 值分布曲線Fig.1 The distributed curve of EC50 value of fluopyram to 127 S. sclerotiorum isolates in Henan Province

2.3 殺菌劑及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌的毒力

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定 結(jié)果 (表3) 顯示：氟吡菌酰胺、丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈6 種殺菌劑對(duì)菌株ZZ1606 的EC50值范圍在0.0175～0.8978 μg/mL 之間，表明6 種藥劑對(duì)油菜菌核病菌的菌絲生長(zhǎng)均具有較好的抑制效果。

表3 氟吡菌酰胺及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌的毒力Table 3 Toxicity of fluopyram and its mixtures to S. sclerotiorum

將氟吡菌酰胺與丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈分別按照1 : 5、1 : 3、1 : 1、3 : 1、5 : 1 體積比進(jìn)行兩元復(fù)配，測(cè)定復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌的聯(lián)合毒力。結(jié)果 (表3) 表明，不同組合、不同配比的復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌的毒力不同，SR 值范圍在0.51～5.86 之間，表現(xiàn)為相加作用或增效作用，其中V(氟吡菌酰胺) :V(咯菌腈) = 1 : 1 時(shí)，SR 值最大，增效作用最強(qiáng)。

3 結(jié)果與討論

氟吡菌酰胺是一種新型的琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHI) 殺菌劑，是廣譜高效內(nèi)吸性殺菌劑，具有保護(hù)和治療作用，通過作用于線粒體呼吸鏈的蛋白復(fù)合物Ⅱ，抑制琥珀酸脫氫酶的活性，從而抑制了病原菌的呼吸作用，使其能量代謝受阻礙，最終使病原菌的生長(zhǎng)受到抑制[19-20]。本研究通過菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺及其復(fù)配劑的敏感性，結(jié)果表明，氟吡菌酰胺對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。黃學(xué)屏等采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了2016—2017年山東省不同蔬菜產(chǎn)區(qū)173 株來自黃瓜、番茄、茄子、西葫蘆、蕓豆和辣椒6 種作物上的菌核病病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性，結(jié)果顯示，氟吡菌酰胺對(duì)173 株菌核病菌的EC50值分布范圍為0.02～0.30 μg/mL，平均值為 (0.11 ± 0.01) μg/mL，EC50頻率分布呈單峰曲線[21]。本研究的敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，氟吡菌酰胺對(duì)供試的127 株油菜菌核病菌的EC50值范圍在0.0100～0.0989 μg/mL 之間，平均值為 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL，EC50頻率分布也是呈單峰曲線。同時(shí)，兩地均未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體。與山東省菌株相比，EC50頻率分布范圍更窄，菌株對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性更高，這可能與菌株的寄主不同或者菌株的群體多樣性有關(guān)。目前，氟吡菌酰胺尚未登記在油菜菌核病的防控上，本研究采集的油菜田塊從未有使用過氟吡菌酰胺，因此，此平均EC50值 (0.0546 ± 0.0228)μg/mL 可以作為河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性基線，為河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的抗藥性監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

SDHI 類殺菌劑的作用位點(diǎn)單一，長(zhǎng)期使用單一藥劑，易導(dǎo)致病原菌抗藥性群體的出現(xiàn)[21-23]。目前，田間已經(jīng)檢測(cè)到了抗SDHI 類殺菌劑啶酰菌胺的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、茄絲核菌Rhizoctonia solani、鏈格孢菌Alternaria alternata和茄鏈格孢菌A.solani等病原菌亞群體[24-26]。但是，關(guān)于油菜菌核病菌對(duì)SDHI 類殺菌劑的田間抗藥性群體報(bào)道較少[27-28]。毛玉帥采用菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定了2018 和2019 年江蘇省油菜菌核病菌對(duì)啶酰菌胺的抗藥性，結(jié)果未檢測(cè)到啶酰菌胺抗性菌株[27]。但是，Li 等對(duì)2014 年從四川省采集的399 株油菜菌核病菌進(jìn)行抗藥性檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到1 株抗啶酰菌胺的田間菌株[28]。由于本研究的供試菌株采集分離較早，且目前氟吡菌酰胺尚未在油菜上登記，未發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株，后續(xù)將增加菌株的采集，監(jiān)測(cè)油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的抗藥性發(fā)展。采用不同作用機(jī)制的殺菌劑復(fù)配使用，是阻止或延緩病原菌抗藥性發(fā)生的主要策略。本研究測(cè)定了SDHI 類殺菌劑氟吡菌酰胺、三唑類殺菌劑丙硫菌唑和葉菌唑、苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、苯吡咯殺菌劑咯菌腈和二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈單劑及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌的毒力。結(jié)果顯示，各殺菌劑及其復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌均具有較高的毒力，且各復(fù)配劑表現(xiàn)相加或增效作用。這可能是由于SDHI 類殺菌劑氟吡菌酰胺與這些殺菌劑具有不同作用機(jī)制，且各組合復(fù)配劑之間作用機(jī)理互不影響[22]。

綜上所述，氟吡菌酰胺對(duì)油菜菌核病菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，未發(fā)現(xiàn)敏感性下降的亞群體，平均EC50值 (0.0546 ± 0.0228) μg/mL 可以作為河南省油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的敏感性基線。氟吡菌酰胺與5 種殺菌劑復(fù)配劑對(duì)油菜菌核病菌均為相加或增效作用，在生產(chǎn)中可以將其與丙硫菌唑、葉菌唑、多菌靈、咯菌腈和菌核凈兩兩復(fù)配使用。本論文的研究結(jié)果為油菜菌核病菌對(duì)氟吡菌酰胺的抗藥性監(jiān)測(cè)和油菜菌核病的防控提供理論。