小兒感冒顆粒中香芹酮檢查方法研究

萬莉，陽文武，向春艷，袁林

重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，三峽庫區(qū)道地藥材開發(fā)利用重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 404000

小兒感冒顆粒是由廣藿香、薄荷、連翹、板藍(lán)根、地骨皮、菊花、大青葉、地黃、白薇、石膏十味中藥制成的中成藥，具有疏風(fēng)解表，清熱解毒止痛之功效［1］。其中薄荷具有疏風(fēng)的功效，是小兒感冒顆粒處方中的重要藥材。留蘭香作為薄荷同屬的植物，其外觀和氣味與薄荷非常相似，難以分辨，近年來成為薄荷的常見易混品。而二者在化學(xué)成分、功效及應(yīng)用領(lǐng)域上均有明顯差異［2］，不能混用。留蘭香的主要成分為香芹酮；薄荷的主要成分為薄荷腦且不含香芹酮。香芹酮是區(qū)別薄荷與留蘭香的指標(biāo)性成分［3］。本研究根據(jù)此特性，采用氣相色譜法對小兒感冒顆粒中香芹酮進(jìn)行檢測，結(jié)果在部分小兒感冒顆粒中檢出了留蘭香指標(biāo)性成分香芹酮，說明有必要建立小兒感冒顆粒中香芹酮的檢查方法，對薄荷進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

氣相色譜儀（島津GC-2010Plus，配置FID 檢測器，日本島津公司）；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（賽默飛TSQ-9000-trace1300，美國賽默飛公司）；ME204T/02、MSE225S 電子天平［梅特勒-托利多科技（中國）有限公司］。薄荷腦、香芹酮對照品（批號分別為：110728-201707、E0019363，純度分別為99.8%、98.2%，分別購自中國食品藥品檢定研究院和北京曼哈格生物科技有限公司）；留蘭香、薄荷對照藥材（批號分別為：310043-202206、120916-202113，分別購自中國食品藥品檢定研究院和上海鴻永生物科技有限公司）；經(jīng)鑒定的廣藿香、連翹、板藍(lán)根、地骨皮、薄荷、菊花、大青葉、地黃、白薇、石膏藥材均來自市售；乙酸乙酯為分析純，水為自制純化水。小兒感冒顆粒均來自市售，由15 個廠家生產(chǎn)共20 批，見表1；相關(guān)陰性樣品為自制。

表1 樣品信息

1.2 溶液制備

1.2.1供試品溶液取小兒感冒顆粒研細(xì)，稱取7 g（相當(dāng)于處方中薄荷0.4 g）置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz ）20 min，放冷，再稱定重量，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2對照品溶液分別精密稱取香芹酮、薄荷腦對照品適量，加乙酸乙酯溶解，得濃度分別為501.32、214.08 μg/mL 的對照品貯備溶液。精密量取貯備溶液各5 mL，加乙酸乙酯定容至50 mL，搖勻，得濃度分別為50.13、21.41 μg/mL 的混合對照品溶液。

1.2.3對照藥材溶液取留蘭香、薄荷對照藥材各1 g，分別加水200 mL，并在揮發(fā)油測定器中加入乙酸乙酯2 mL，照揮發(fā)油測定法（《中國藥典》2020 年版四部通則2204［4］）保持微沸2.5 h，分取乙酸乙酯層作為對照藥材溶液。

1.2.4陰性樣品溶液按小兒感冒顆粒的處方比例，取除薄荷外的其他藥材制備陰性樣品溶液。

1.3 氣相色譜法（GC 法）

1.3.1色譜條件色譜柱為HP-5（5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液，30 m×0.32 mm×0.5 μm）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；FID 檢測器溫度230 ℃；分流比10∶1；程序升溫（初始溫度90 ℃，保持3 min，以30 ℃/min 的速率升溫至160 ℃，保持8 min，再以10 ℃/min 的速率升溫至180 ℃保持2 min）；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.2專屬性考察取“1.2”項(xiàng)下的4 類溶液分別進(jìn)樣，在“1.3.1”項(xiàng)規(guī)定的色譜條件下檢測，結(jié)果見圖1。由色譜圖可見，檢出香芹酮的小兒感冒顆粒（以下稱為陽性樣品）在香芹酮對照品保留時間處出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，薄荷藥材、薄荷腦對照品及陰性樣品在香芹酮對照品保留時間處均未出現(xiàn)色譜峰，說明薄荷藥材及處方中其他藥材均無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 氣相色譜圖：A.對照品溶液；B.薄荷對照藥材溶液；C.留蘭香對照藥材溶液；D.陰性樣品溶液；E.未檢出香芹酮的樣品溶液；F.檢出香芹酮的樣品溶液

1.3.3線性關(guān)系考察精密量取“1.2.2”項(xiàng)下制備的香芹酮對照品貯備溶液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mL，分別用乙酸乙酯定容至10 mL，在“1.3.1”項(xiàng)規(guī)定的色譜條件下檢測。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），其濃度為橫坐標(biāo)（X）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果線性回歸方程為Y=3 893.4X-2 178.5，線性范圍為1.07～42.82 μg/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2，表明線性關(guān)系良好。

1.3.4精密度試驗(yàn)取濃度為21.41 μg/mL 的香芹酮對照品溶液1μL，在“1.3.1”項(xiàng)規(guī)定的色譜條件下連續(xù)檢測6 次，峰面積RSD 為0.93%（n=6），表明儀器精密度良好。

1.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)以小兒感冒顆粒陽性樣品的供試品溶液為實(shí)驗(yàn)對象，分別于供試品溶液制備后0、4、8、12、16、24 h 檢測，結(jié)果香芹酮峰面積RSD 為1.12%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.6重復(fù)性試驗(yàn)稱取小兒感冒顆粒陽性供試品6份，照“1.2.1”項(xiàng)下規(guī)定的步驟處理樣品，在“1.3.1”項(xiàng)規(guī)定的色譜條件下檢測，結(jié)果香芹酮峰面積RSD為1.35%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.7加樣回收率試驗(yàn)取已知香芹酮含量為12.16 μg/g 的小兒感冒顆粒陽性樣品6 份，每份約3.5 g，精密稱定，分別精密加入濃度為21.41 μg/mL的香芹酮對照品溶液1.60、2.00、2.40 mL 各3 份，再分別加乙酸乙酯使總體積為20.00 mL，照“1.2.1”項(xiàng)下方法處理樣品，照“1.3.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件檢測，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

1.3.8檢出限稱取樣品1 g，加入不同濃度的香芹酮對照品溶液適量，照“1.2.1”項(xiàng)下的步驟處理樣品，照“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件檢測，以信號噪聲比為3 時1 g 樣品中加入對照品的量作為檢出限，最終測得檢出限為1 μg/g（S/N=3）。

1.4 GC-MS/MS 聯(lián)用法

1.4.1色譜條件色譜柱為DB-1701MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度200 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度300 ℃；柱溫箱50 ℃保持1 min，再以5 ℃/min 升溫至150 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min升溫至200 ℃保持5 min，進(jìn)樣量1 μL。SIM 模式；正離子方式掃描；薄荷腦特征離子為55、67、81、95、123、138，香芹酮特征離子為39、54、82、93、108。

1.4.2樣品確證在GC 法供試品色譜圖中，應(yīng)不得出現(xiàn)與香芹酮對照品保留時間相同的色譜峰，如出現(xiàn)與香芹酮對照品保留時間相同的色譜峰，應(yīng)采用GC-MS/MS 聯(lián)用儀，按照“1.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)一步確證，其一級質(zhì)譜不得與香芹酮對照品一致。

2 樣品檢測結(jié)果

取20 批小兒感冒顆粒樣品，照“1.2.1”項(xiàng)下方法處理樣品，按“1.3.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件測定香芹酮，結(jié)果GC 法檢出與香芹酮對照品保留時間相同色譜峰的樣品有3 批。經(jīng)GC-MS/MS 確證，有2 批為陽性，香芹酮含量分別為2.13 μg/g 和12.16 μg/g。1 批經(jīng)驗(yàn)證為假陽性，可能系原輔料中的其他雜質(zhì)造成。由此說明，即使GC 法檢出與香芹酮保留時間一致的色譜峰，仍需GC-MS/MS 進(jìn)一步確證，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 討論

3.1 提取溶劑及提取時間的確定

曾對不同提取溶劑（甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯）和超聲時間（10、20、30、40 min）進(jìn)行考察，以香芹酮的提取率以及色譜圖中雜質(zhì)峰數(shù)量等為考察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取率較高且雜質(zhì)峰較少，超聲時間20 min 之后香芹酮含量無明顯增加，最終確定為采用乙酸乙酯超聲20 min。

3.2 香芹酮限量的探討

目前薄荷及含薄荷中成藥檢出香芹酮成分有相關(guān)文獻(xiàn)報道［5-6］。本實(shí)驗(yàn)收集的20 批樣品，2 批檢出含香芹酮，占10%。但檢出并不意味著不合格，因?yàn)楦鶕?jù)《中國藥典》2020 年版四部0212 藥材和飲片檢定通則的規(guī)定，飲片雜質(zhì)通常應(yīng)不得過3%。因此小兒感冒顆粒中含有多少香芹酮評定為不合格，尚需制定合理的限量值來進(jìn)行判定。限量值的確定可以從供試品溶液制備時取樣量、薄荷藥材允許的雜質(zhì)量、留蘭香中香芹酮的平均含量等方面來考慮。本研究將會在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中對此進(jìn)行更深入的探討。