脊髓性肌萎縮癥中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白缺失抑制p53泛素化降解致其積累的研究

盛蕾 蔣鳳仙 戴俊

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)隱性遺傳病，2018年被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)列為第一批罕見(jiàn)病，在新生兒中發(fā)病率為1/6 000～1/10 000［1］，目前我國(guó)約有5 萬(wàn)病人；其特點(diǎn)是脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，導(dǎo)致肢體近端和軀干肌肉進(jìn)行性萎縮和癱瘓，最終因呼吸衰竭而死亡［2］。SMA 是由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因1（SMN1）的缺失或突變導(dǎo)致不能編碼正常的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白（SMN）［3］。SMN 蛋白廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞，是細(xì)胞生存的必需蛋白［4］，主要協(xié)助小核糖核酸蛋白（sn-RNP）的組裝，參與前體mRNA（Pre-mRNA）的剪接過(guò)程［4-5］，同時(shí)也可能參與泛素穩(wěn)態(tài)、核轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。

目前SMA的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，SMN蛋白缺失如何選擇性引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和機(jī)制研究指出腫瘤抑制基因trp53可能參與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性過(guò)程［6-10］。早期研究證明，SMN蛋白可以與p53相互作用，但SMN缺失后，p53 蛋白未減少［11］。Simon 等［10］的研究表明，在SMA 小鼠模型中p53 激活導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。其進(jìn)一步研究指出SMN 蛋白缺失引起snRNP組裝紊亂，導(dǎo)致p53的負(fù)調(diào)控因子Mdm2和Mdm4剪接發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致p53激活，最終引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，然而，通過(guò)調(diào)控Mdm2和Mdm4剪接并未有效拯救SMA小鼠［9］。因此p53蛋白的激活可能有其他的調(diào)控機(jī)制。最近研究指出p53 下游相關(guān)基因（Fas、Noxa和Cdkn1a）轉(zhuǎn)錄水平的變化與神經(jīng)肌肉接頭的病理現(xiàn)象密切相關(guān)［8］。Reedich等［6］的研究也表明SMA中p53被激活，進(jìn)而激活下游細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，Cdkn1a），導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。但是對(duì)于SMN蛋白缺失調(diào)控p53信號(hào)激活的分子機(jī)制仍不明確。

為了探究SMN蛋白缺失導(dǎo)致p53信號(hào)激活的機(jī)制，我們利用慢病毒構(gòu)建了Smn敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系NSC34，深入探究SMN 蛋白缺失導(dǎo)致p53 激活的分子機(jī)制，進(jìn)一步解析SMA 小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中p53 的變化，旨在為SMA的病理機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SMA 轉(zhuǎn)基因鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson 實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)與繁殖按照蘇州大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)所批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針和規(guī)程（倫理批準(zhǔn)號(hào)：202010A177）。由雜合子（Smn+/-）和溫和型SMA 小鼠（Smn-/-，SMN22TG/2TG）繁殖產(chǎn)生嚴(yán)重型SMA 小鼠模型（Smn-/-，SMN22TG/0），同窩雜合子（Smn+/-，SMN22TG/0）小鼠用于實(shí)驗(yàn)對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)均選擇雌鼠，以避免因性別差異引起的混淆效應(yīng)。

二、試劑與儀器

胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；基因型鑒定試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和PCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SMN單克隆抗體（貨號(hào)：610646）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；p53 鼠單克隆抗體（貨號(hào)：ab26）、p21 兔單克隆抗體（貨號(hào)：ab109520）和Noxa 鼠單克隆抗體（貨號(hào)：ab13654）均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；磷酸化p53（Ser18）兔單克隆抗體（貨號(hào)：9284）、乙?；痯53（K382）兔單克隆抗體（貨號(hào)：2525）和MDM2 兔單克隆抗體（貨號(hào)：86934）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH鼠單克隆抗體（貨號(hào)：60004）購(gòu)自武漢Proteintech 公司。pCGT7、pCI-neo、pTRIPZ、pMD2.G、pSPAX2、pREV 和pTAT 等質(zhì)粒載體由美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室Adrian R.Krainer教授惠贈(zèng)。

激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國(guó)）；熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)）；熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)）；化學(xué)發(fā)光儀（GE公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Beckman 公司，美國(guó)）；RT-PCR 儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽（Bio-Rad 公司，美國(guó)）；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司，中國(guó)）。

三、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

利用慢病毒感染NSC34 細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到shRNA穩(wěn)定整合細(xì)胞基因組的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系；用96 孔板篩選挑取單克隆；篩選出NSC34 穩(wěn)定株后，待細(xì)胞貼壁完全，在12 個(gè)孔中加入不同濃度多西環(huán)素（doxycycline，DOX）誘導(dǎo)基因敲低，每隔12小時(shí)于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，拍照記錄熒光強(qiáng)度最大的DOX最低濃度，經(jīng)過(guò)篩選最適濃度為1 mg/mL。

四、細(xì)胞培養(yǎng)和處理

NSC34細(xì)胞系在添加10%胎牛血清和抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至密度為80%～90%，按5×104/mL接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁完全后加入1 mg/mL 的DOX進(jìn)行誘導(dǎo)，1～5天后進(jìn)行基因和蛋白水平、免疫熒光染色和細(xì)胞周期等檢測(cè)。

五、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行RNA 提??；檢測(cè)RNA 的純度與濃度后將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；進(jìn)行熒光定量PCR；通過(guò)2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

六、蛋白質(zhì)印跡

細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞后，用10%SDS-PAGE 分離蛋白樣品。用5%脫脂牛奶孵育2 h，然后一抗4 ℃孵育過(guò)夜：SMN（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）、p-p53（Ser18）（1∶1 000）、MDM2（1∶1 000）、p21（1∶1 000）、Noxa（1∶1 000）和Acetyl-p53（Lys382）（1∶1 000）。TBST 洗滌3 次，室溫孵育二抗1 h 后通過(guò)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)并保存分析數(shù)據(jù)。

七、免疫共沉淀

DOX 誘導(dǎo)48 h 后進(jìn)行免疫共沉淀（IP）。收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心30 min 后取上清；取少量上清液作為input 以備Western Blot 分析，剩余上清液中加p53抗體，4 ℃孵育1 h；取40 μL protein A/G瓊脂糖珠，裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm 離心3 min；將預(yù)處理過(guò)的40 μL protein A/G 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育的細(xì)胞裂解液中，4 ℃緩慢搖晃孵育過(guò)夜；免疫沉淀反應(yīng)后，在4 ℃以3 000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 mL 裂解緩沖液洗3～4 次；最后加入適量裂解液和上樣緩沖液，沸水煮5 min；進(jìn)行Western Blot分析。

八、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。用FlowJo_V10 軟件（BD Biosciences）對(duì)不同細(xì)胞周期階段細(xì)胞的分布進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

九、免疫熒光染色

小鼠出生后5天用CO2窒息法處死，取脊髓組織樣本，組織立即用生理鹽水沖洗，放入液氮中冷凍，后儲(chǔ)存于零下80 ℃冰箱，進(jìn)行基因和蛋白檢測(cè)。進(jìn)行免疫熒光染色的樣本，取材后放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h。在PBS中清洗3次，進(jìn)行石蠟包埋切片；組織切片56 ℃加熱20 min后進(jìn)行不同濃度乙醇脫水；將切片放入檸檬酸鈉緩沖液中，放入壓力鍋中，高壓15 min；將切片放入TBS 中20 min；將切片放入封閉液中通透1 h；孵育一抗單克隆抗體ChAT，4 ℃過(guò)夜；孵育二抗，室溫2 h；TBS清洗3次，將切片晾干，封閉；激光共聚焦顯微鏡下觀察。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用GraphPad Prism 8.0 軟件（GraphPad Software公司，美國(guó)）和SPSS 26.0軟件（IBM公司，美國(guó)）進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，分別采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異分析或單因素方差分析進(jìn)行組間差異分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SMN蛋白缺失導(dǎo)致p53積累

在構(gòu)建的Smn敲低的NSC34 細(xì)胞中，第1 天Smn敲低效率為80%左右，第3 天效率為85%左右，第5天效率為90%左右（圖1 a）。

圖1 SMN 蛋白缺失導(dǎo)致p53 積累 a：構(gòu)建的NSC34 細(xì)胞中，誘導(dǎo)1～5 天的Smn 基因敲低效率；b：誘導(dǎo)后1～4 天trp53 基因表達(dá)未變化，第5 天表達(dá)上調(diào)；c：構(gòu)建的NSC34 細(xì)胞中SMN 蛋白表達(dá)下調(diào)，p53 蛋白表達(dá)增加；d、e：SMN 和p53 蛋白灰度值定量分析柱狀圖（與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

我們檢測(cè)了SMN 蛋白缺失的NSC34 細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)trp53基因水平的變化，與對(duì)照組相比，在早期，SMN 的缺失并沒(méi)有改變trp53mRNA 的豐度；在誘導(dǎo)的晚期第5 天表達(dá)增加（圖1 b，P＜0.05），但是由于p53 蛋白水平的變化遠(yuǎn)早于基因水平的變化，故不考慮晚期基因水平的改變。

在NSC34 細(xì)胞中的SMN 蛋白在第2 天、第3 天和第5 天分別降低了70%、85%和97%；而p53 蛋白水平在第2、3、5 天分別上調(diào)了3、8、6 倍（圖1 c～e，P＜0.05）。

以上結(jié)果證實(shí)在SMA 細(xì)胞模型中SMN 蛋白缺失會(huì)導(dǎo)致p53蛋白積累，但其基因水平未發(fā)生變化。

二、SMN蛋白缺失抑制p53的降解

考慮到trp53早期轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化，我們推測(cè)SMN缺乏可能會(huì)影響p53的穩(wěn)定性。蛋白合成抑制劑放線菌酮（Cycloheximide，CHX）處理NSC34 細(xì)胞12 h后，p53蛋白水平下降了28%；然而，在Smn敲低組中只觀察到p53蛋白水平輕微下降（圖2 a、b，P＜0.05）。以上結(jié)果提示，SMN蛋白缺失抑制p53的降解進(jìn)而導(dǎo)致其積累。p53是通過(guò)泛素化途徑進(jìn)行降解，MDM2 作為p53 最主要的E3 泛素連接酶和下游調(diào)控靶點(diǎn)。Smn敲低組中p53 蛋白水平升高后，MDM2 基因和蛋白表達(dá)均顯著上升（圖2 c～e，P＜0.05），但是免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)MDM2 與p53 的相互結(jié)合顯著減少（圖2 f）。以上結(jié)果表明，SMN蛋白缺失后通過(guò)抑制p53泛素化降解途徑導(dǎo)致其積累。

圖2 SMN 蛋白缺失抑制p53 降解 a：NSC34細(xì)胞中，CHX抑制蛋白合成后，p53蛋白發(fā)生降解，蛋白水平下降，Smn 敲低組的p53 蛋白水平未發(fā)生顯著變化；b：p53 蛋白灰度值定量分析柱狀圖；c：Smn敲低組中，MDM2 基因相對(duì)表達(dá)上升；d：Smn 敲低組的MDM2 蛋白表達(dá)增加；e：MDM2 蛋白灰度值定量分析柱狀圖；f：IP檢測(cè)p53 與MDM2 結(jié)合情況（與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

三、SMN 蛋白缺失導(dǎo)致p53 磷酸化和乙?；揎椝皆黾?/h3>

敲低Smn后，NSC34 細(xì)胞中p-p53（Ser18）蛋白水平顯著升高（圖3 a），免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞核中發(fā)生積累（圖3 d）。p-p53（Ser18）蛋白水平升高會(huì)激活下游k382乙酰化，而泛素化和乙?；Y(jié)合的賴氨酸位點(diǎn)是相互競(jìng)爭(zhēng)，我們檢測(cè)到acetyl-p53（K382）水平顯著上升（圖3 a～c）。以上結(jié)果表明：p53 磷酸化和乙酰化的激活抑制了MDM2 與p53 的結(jié)合，最終抑制其泛素化降解。

圖3 SMN蛋白缺失導(dǎo)致p53磷酸化和乙?；揎椝皆黾?a：NSC34 細(xì)胞中，SMN 蛋白缺失后p-p53（Ser18）和acetylp53（K382）蛋白表達(dá)上調(diào)；b、c：p-p53（Ser18）和acetyl-p53（K382）蛋白灰度值定量分析柱狀圖；d：免疫熒光染色在Smn敲低的NSC3 中p-p53（Ser18）蛋白表達(dá)增加（與對(duì)照組比較，***P＜0.001）

四、p53蛋白積累導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡

p53蛋白積累必然會(huì)引起下游細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。SMN 蛋白缺失后，G0/G1 期細(xì)胞數(shù)量減少，但S 期的細(xì)胞數(shù)量顯著增高，G2/M 期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖4 a、b，P＜0.05）。細(xì)胞周期抑制基因Cdkn1a顯著上升，同時(shí)凋亡相關(guān)基因Bax、Noxa和PUMA顯著上升（圖4 c，P＜0.05）。為了驗(yàn)證SMA 中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化，通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)在SMA 小鼠模型中腰髓L1～L2段運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（圖4 d）。在SMA小鼠脊髓組織中同樣檢測(cè)到細(xì)胞周期抑制基因Cdkn1a顯著上升，凋亡相關(guān)基因Bax、Noxa和PUMA顯著上升；且p-p53（Ser18）和acetyl-p53（K382）蛋白水平顯著增加，p53 下游抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的p21和Noxa蛋白高表達(dá)（圖4 e、f，P＜0.05）。

圖4 p53蛋白積累導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡 a：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布；b：細(xì)胞周期分布統(tǒng)計(jì)圖，S 期細(xì)胞數(shù)量增多，G2/M 期細(xì)胞數(shù)量減少；c：NSC34細(xì)胞中Smn 敲低后Cdkn1a、Bax、Noxa 和PUMA 基 因 表 達(dá) 增 高；d：SMA 小鼠模型的脊髓組織運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元染色；e：SMA 小鼠模型的脊髓組織中Cdkn1a、Bax、Noxa和PUMA 基因的表達(dá)水平上調(diào)；f：SMA小鼠模型的脊髓組織中p53 相關(guān)蛋白均表達(dá)增加（與對(duì)照 組 比 較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

討 論

SMA 是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)隱性遺傳病，它是由SMN1基因的缺失或突變導(dǎo)致不能正常編碼SMN 蛋白導(dǎo)致。針對(duì)其致病基因，目前臨床上用于治療SMA的藥物有反義寡核苷酸藥物Nusinersen及腺相關(guān)病毒基因療法Zolgensma。但是對(duì)于SMN 蛋白缺失是如何引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的病理機(jī)制尚不完全清楚，且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的分子機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。前期研究指出在SMA小鼠模型中p53的激活導(dǎo)致了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。但是關(guān)于SMN蛋白調(diào)控p53的分子機(jī)制鮮有報(bào)道，因此本研究致力于探究SMN蛋白缺失導(dǎo)致p53激活的分子機(jī)制。

一、SMN 蛋白缺失導(dǎo)致泛素-蛋白酶體系統(tǒng)破壞引起p53蛋白積累

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)p53通過(guò)泛素-蛋白酶體降解途徑維持在較低水平，但在DNA損傷或細(xì)胞應(yīng)激情況下會(huì)迅速激活并穩(wěn)定［12］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SMN 蛋白缺失會(huì)抑制p53 降解，提高蛋白穩(wěn)定性。研究表明，SMA 小鼠模型中存在泛素穩(wěn)態(tài)失衡，SMN蛋白與泛素蛋白酶體系統(tǒng)相互作用不僅調(diào)節(jié)自身穩(wěn)定性，其缺失還導(dǎo)致神經(jīng)肌肉發(fā)病［13-16］。其中，SMN缺失降低泛素樣修飾物激活酶1（UBA1）的水平，通過(guò)破壞泛素穩(wěn)態(tài)促進(jìn)神經(jīng)退行性病變［13］。作為去泛素化酶泛素羧基末端水解酶家族的一員，泛素羧基末端水解酶L1（UCHL1）在SMA 病人中表達(dá)顯著上調(diào)［16］。Reddy 等［17］研究表明，UCHL1 表達(dá)升高后通過(guò)穩(wěn)定p53導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，UCHL1 與阿爾茨海默病、帕金森病以及其他神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［18］。因此，SMN蛋白缺失導(dǎo)致p53蛋白穩(wěn)定性的增加可能是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的破壞引起的。

二、SMN 蛋白通過(guò)調(diào)控p53 蛋白翻譯后修飾抑制泛素化降解

除了上述泛素樣修飾物激活酶和去泛素化酶參與調(diào)控蛋白泛素化降解，E3泛素連接酶決定靶蛋白的特異性識(shí)別，在泛素途徑中具有重要的作用。MDM2作為p53最主要的E3泛素連接酶和下游調(diào)控靶點(diǎn)，通過(guò)形成負(fù)反饋環(huán)路來(lái)調(diào)節(jié)p53 的功能［19-20］。我們的研究顯示p53 表達(dá)上調(diào)后MDM2 顯著上升。正常情況下MDM2 的上升會(huì)促進(jìn)p53 泛素化降解，但是p53 與MDM2 的相互結(jié)合顯著減少。p53 的穩(wěn)定性和功能受到翻譯后修飾的調(diào)控，包括泛素化、磷酸化和乙?；?9，21］。p53 在Ser15（小鼠是Ser18）位點(diǎn)的磷酸化被認(rèn)為是p53 激活的啟動(dòng)事件，可以保護(hù)p53 不受其主要負(fù)調(diào)控因子MDM2 的影響，從而提高其穩(wěn)定性和功能；且p-p53（Ser18）可以調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡［22］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SMN蛋白缺失后，p-p53（Ser18）水平顯著升高，細(xì)胞周期G2/M期發(fā)生阻滯且細(xì)胞凋亡增加，證實(shí)p53 的穩(wěn)定性增加及功能受到磷酸化水平影響。此外，p53在Ser15位點(diǎn)磷酸化可以通過(guò)招募CBP/p300 促進(jìn)乙?；?3］。乙酰化和泛素化可以修飾p53碳端相同的賴氨酸殘基，包括K370、K372、K373、K381、K382 和K386，這些位點(diǎn)的乙?；梢宰柚筽53 被泛素化，從而增加其穩(wěn)定性［24-26］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在SMA 小鼠模型的脊髓組織和Smn敲低的NSC34 細(xì)胞中p53 的K382 乙酰化水平增加。表明SMN 蛋白缺失是通過(guò)激活p-p53（Ser18）和acetyl-p53（K382）修飾干擾p53和MDM2之間相互作用，抑制泛素化降解，進(jìn)而導(dǎo)致p53蛋白積累。

本研究中，我們采用了Smn敲低的NSC34 細(xì)胞去探究p53 積累的分子機(jī)制，并且在SMA 小鼠模型的脊髓組織中進(jìn)行了驗(yàn)證。然而我們必須認(rèn)識(shí)到該研究存在一定局限性，如：我們對(duì)p53積累未在SMA小鼠脊髓組織中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中進(jìn)行驗(yàn)證，且未在SMA病人來(lái)源的細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。因此，下一步我們將分別從SMA 小鼠模型脊髓組織的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和病人來(lái)源的細(xì)胞對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SMN 蛋白缺失導(dǎo)致p53蛋白p-p53（Ser18）和acetyl-p53（K382）水平增加，抑制p53 與MDM2 結(jié)合，進(jìn)而抑制p53 泛素化降解，最終導(dǎo)致p53 蛋白積累，引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡（圖5）。靶向調(diào)控p53 的泛素化降解途徑可能為SMA的治療提供新的思路。

圖5 SMN蛋白缺失導(dǎo)致p53積累的分子機(jī)制圖