止痙散調(diào)控腸道菌群治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用及安全性評(píng)價(jià)研究

王志衡　高楊　林聃　朱立忠　蘇克雷　胡春萍　葉娟　王大為

摘要：目的研究止痙散治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的新機(jī)制及安全性。方法本研究采用牛Ⅱ型膠原兩次免疫誘導(dǎo)法造小鼠關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，將造模成功小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組，甲氨蝶呤組和止痙散組，每日灌胃給藥，記錄小鼠體重，足爪關(guān)節(jié)的腫脹程度，并采集小鼠結(jié)腸、直腸和盲腸區(qū)段的糞便，利用二代測(cè)序方法，檢測(cè)止痙散對(duì)小鼠腸道菌群的影響，同時(shí)對(duì)各臟器進(jìn)行病理檢查。利用ICR小鼠最大給藥劑量（16 g/kg）急性毒性實(shí)驗(yàn)和人等效給藥量（0.18 g/kg）亞急性毒性試驗(yàn)檢測(cè)ZJS安全性。結(jié)果止痙散能夠顯著緩解小鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低關(guān)節(jié)炎評(píng)分，降低關(guān)節(jié)部位IL-6和IL-2的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞的數(shù)量。測(cè)序結(jié)果表明，止痙散顯著降低直腸部位腸道菌群的Chao1指數(shù)和shannon指數(shù)，而在結(jié)腸、盲腸部位無(wú)明顯變化。在門(mén)水平，止痙散升高直腸、盲腸部位擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)豐度，降低直腸、盲腸部位厚壁菌門(mén)，大腸桿菌門(mén)，變形菌門(mén)豐度；在屬水平上，止痙散降低直腸與盲腸部位螺桿菌、毛螺菌、理研菌、另支菌屬豐度，升高乳桿菌、擬桿菌屬豐度。在止痙散急性毒性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，與正常組相比，止痙散組的臟器病理及血生化指標(biāo)無(wú)顯著性差異。結(jié)論止痙散能夠增加直腸和盲腸部位有益菌群、降低腸道有害菌，恢復(fù)腸道微生物穩(wěn)態(tài)環(huán)境從而改善類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的癥狀，且在止痙散的用藥過(guò)程中無(wú)明顯毒副作用。

關(guān)鍵詞：止痙散；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；腸道菌群

中圖分類(lèi)號(hào)：R593.22文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2023）05-0084-10

Study on the Effect and Safety Evaluation of Antispasmodic Powder on Regulating

Intestinal Flora in the Treatment of Rheumatoid Arthritis

WANG Zhi-heng GAO Yang LIN Dan ZHU Li-zhong SU Ke-lei

HU Chun-ping YE Juan WANG Da-wei

（1. The Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Nanjing University

of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China;

2. Jiangsu Institute of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China）

【Abstract】Objective： To study the new mechanism and safety of Antispasmodic Powder in the treatment of rheumatoid arthritis（RA）. Methods： The mouse model of collagen induced arthritis（CIA）was constructed by double immune induction of bovine type II collagen. The successfully constructed mice were randomly divided into normal control group，model group，methotrexate group and antispasmodic powder group. The mice were given daily intragastric administration，and the body weight and swelling degree of paw joint were recorded. The feces of colon，rectum and cecum of the mice were collected，and the effect of antispasmodic powder on intestinal microflora of the mice was detected by the second-generation sequencing method and the pathological examination of each organ was performed. The maximum dose of ICR in mice（16 g/kg）and equivalent dose in humans（0.18 g/kg）were used to test the safety of ZJS. Results： Antispasmodic powder could significantly relieve the joint swelling，reduce the arthritis score，reduce the expression of IL-6 and IL-2，and decrease the number of osteoclasts. The sequencing results showed that the Chao1 index and Shannon index of intestinal flora in the rectum were decreased significantly，but there was no significant change in the colon and cecum. At the phylum level，antispasmodic powder increased the abundance of bacteroidetes and actinomyces in the rectum and cecum，and decreased the abundance of firmicutes，escherichia coli and proteobacteria in the rectum and cecum. At the generic level，antispasmodic powder decreased the abundance of helicobacter，lachnospira，rikenella and mycobacterium in the rectum and cecum，and increased the abundance of lactobacillus and bacteroides. In the acute toxicity test of antispasmodic powder，the organ pathology and blood biochemical indexes of the antispasmodic powder group showed no significant difference compared with the normal group. Conclusion： Antispasmodic powder can increase the beneficial bacteria community in rectum and cecum，reduce the harmful bacteria in intestinal tract，restore the homeostasis environment of intestinal microorganisms，and improve the symptoms of mice with rheumatoid arthritis. In addition，antispasmodic powder has no obvious toxic and side effects during the administration.

【Key words】Antispasmodic Powder; Rheumatoid Arthritis; Intestinal Flora

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎癥及關(guān)節(jié)炎病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)，損害性大，嚴(yán)重威脅患者的生命健康［1-3］。甲氨蝶呤作為RA的一線藥物，但容易引起胃腸道、骨髓抑制等副作用［4］。止痙散由全蝎和蜈蚣組成，《秘驗(yàn)奇珍》中記載蟲(chóng)藥止痙散治療痙攣抽搐，風(fēng)濕頑痹，對(duì)于風(fēng)寒濕痹久治不愈，甚至關(guān)節(jié)變形作用頗佳。我們前期研究證實(shí)止痙散通過(guò)抑制 RANKL/NF-кB 介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，阻止膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠關(guān)節(jié)骨破壞，治療RA［5］。但是，止痙散化學(xué)成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多，對(duì)機(jī)制展開(kāi)深入的研究，并對(duì)其用藥安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，將為止痙散臨床應(yīng)用的推廣具有重要意義。

研究表明，腸道微生物失調(diào)與膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎有關(guān)，腸道微生物群落的失調(diào)可能是觸發(fā)RA發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)境因素并影響RA的發(fā)生與發(fā)展［6-8］。早期研究表明，腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌分泌的某些毒素被吸收后會(huì)導(dǎo)致RA的發(fā)生［9］。近年來(lái)的研究表明，RA患者腸道中柯林斯菌屬大量增殖，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)加重往往導(dǎo)致RA患者病情加重。同時(shí)隨著RA患者的治療，腸道菌群物種多樣性增加，腸道菌群失調(diào)部分有明顯恢復(fù)趨勢(shì)［10］。腸道菌群的失調(diào)可能引起腸道通透性增加，導(dǎo)致某些病原微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，誘發(fā)RA。腸道菌群失調(diào)可能通過(guò)導(dǎo)致Th17-Treg失衡或tfh細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)誘導(dǎo)RA的發(fā)生［11-12］。

我們前期的研究已經(jīng)證明止痙散能夠有效治療RA［5］。但止痙散是否通過(guò)改善腸道菌群失調(diào)治療RA目前尚不明確，亦無(wú)相關(guān)報(bào)道。故本研究以CIA小鼠為研究對(duì)象，探討止痙散通過(guò)改善腸道菌群失調(diào)治療RA的新機(jī)制及其安全性，為止痙散的推廣應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1材料

1.1動(dòng)物6～7周健康雄性DBA/1J小鼠，SPF級(jí)，體重（18±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010］。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間光暗循環(huán)12 h，自由飲水，隨后采用完全隨機(jī)分組方法，分為正常組，模型組和止痙散給藥組。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物炮制全蝎（批號(hào)：20180601，生產(chǎn)于杭州振德中藥飲片有限公司）、炮制蜈蚣（批號(hào)：18080115，生產(chǎn)于鄭州瑞龍制藥股份有限公司）、甲氨蝶呤（批號(hào)：H31020644，生產(chǎn)于上海上藥信誼藥廠有限公司）。止痙散由全蝎和蜈蚣按照1∶1的比例組成，全蝎和蜈蚣及甲氨蝶呤購(gòu)自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑牛Ⅱ型膠原（Chondrex公司，20021）；完全弗氏佐劑（Chondrex公司，7023）；不完全弗式佐劑（Chondrex公司，7002）。

1.4實(shí)驗(yàn)儀器低溫行星式球磨機(jī)（南京萊步科技實(shí)業(yè)有限公司，QM-DK4）；數(shù)字式肢體腫脹測(cè)量?jī)x（IITC Life Science公司，502MR）；小動(dòng)物Micro CT顯微掃描儀（Bruker公司，SkyScan 1176）；超純水系統(tǒng)（Millipore公司，Milli-Q Biocel）。

1.5方法

1.5.1藥物制備蜈蚣去頭足后粉碎，過(guò)80目篩，60°C過(guò)夜烘干，隨后用球磨機(jī)打磨成更細(xì)的粉末。全蝎粉碎過(guò)80目篩，60°C過(guò)夜烘干，隨后用球磨機(jī)打磨成更細(xì)的粉末。等量稱取蜈蚣與全蝎粉末，混勻后加雙蒸水溶解成濃度為6.48 mg/mL的混懸液，給藥時(shí)搖晃均勻灌胃即可。

1.5.2動(dòng)物造模分組及給藥DBA/1J小鼠用牛II型膠原免疫造模法造CIA模型［14］。二次免疫后，等造模小鼠發(fā)病率達(dá)到80%左右時(shí)，隨機(jī)分組，分為正常組，模型組，甲氨蝶呤組（0.92 mg/kg，2次/周）以及止痙散組（0.18 g/kg，1次/天）［5］，每天灌胃給藥1次），每組7只。

1.5.3觀察指標(biāo)觀察各組小鼠精神狀態(tài)，毛色，記錄體重，關(guān)節(jié)腫脹以及關(guān)節(jié)畸形情況，并按如下標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行評(píng)分，四肢沒(méi)有紅斑或腫脹（0分）；開(kāi)始出現(xiàn)紅斑和輕度腫脹，并延伸至跗骨或踝關(guān)節(jié)（1分）；從踝關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)紅斑和輕度腫脹（2分）；踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹（3分）；踝關(guān)節(jié)、足和手指周?chē)t斑和嚴(yán)重腫脹，肢體強(qiáng)直、變形（4分）。

1.5.4取材小鼠造模成功后，連續(xù)給藥一月，最后一次給藥后處死小鼠，取各組小鼠的足爪關(guān)節(jié)，用4%多聚甲醛固定，分別取結(jié)腸，直腸，盲腸腸段的腸道內(nèi)容物。足爪關(guān)節(jié)進(jìn)行Micro-CT的檢測(cè)，腸道內(nèi)容物進(jìn)行16S片段測(cè)序。并取小鼠心、肝、肺、腎進(jìn)行病理檢測(cè)。

1.5.5腸道菌群16S片段測(cè)序及分析使用DNA試劑盒抽提基因組DNA（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提。將抽提的基因組DNA跑1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)按指定基因組DNA，測(cè)序V3-V4區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。Illumina PE250文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序，隨后進(jìn)行Illumina PE250測(cè)序。將測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5.6初步毒性評(píng)價(jià)

1.5.6.1止痙散單日最大給藥劑量對(duì)ICR小鼠的急性毒性評(píng)價(jià)急性毒性試驗(yàn)中將ICR小鼠分為正常組和止痙散組，止痙散單日給藥劑量為16 g/kg（相當(dāng)于人臨床給藥劑量的960倍），配置濃度為0.2 g/mL，給藥容積為0.4 mL/10 g，分2次給藥，每次間隔8 h。正常對(duì)照組給予同體積雙蒸水作為空白對(duì)照。給藥結(jié)束后持續(xù)觀察1周時(shí)間，隨后將小鼠解剖，取心肝肺腎，多聚甲醛固定后，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及血生化檢查。

1.5.6.2止痙散人等效劑量對(duì)ICR小鼠的亞急性毒性評(píng)價(jià)止痙散人等效給藥量亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中，將普通ICR小鼠分為2組，正常組灌胃雙蒸水，止痙散組灌胃止痙散（0.18 g/kg，1次/d）。連續(xù)給藥30 d，給藥過(guò)程中，每天記錄小鼠體重。給藥結(jié)束后，分離小鼠心、肝、肺、腎等器官，4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及血生化檢查，初步評(píng)價(jià)止痙散人等效給藥量（0.18 g/kg）對(duì)CIA小鼠的亞急性毒性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad_Prism_8.0.2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差齊者多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀比較實(shí)驗(yàn)整體流程見(jiàn)圖1a；與模型組對(duì)比，止痙散組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)骨侵蝕程度明顯減輕（圖1b）；關(guān)節(jié)評(píng)分結(jié)果顯示止痙散組的評(píng)分與正常組相比無(wú)差異但是與模型組相比有顯著降低（圖1c）；止痙散組與正常組小鼠相比體重沒(méi)有明顯差異（圖1d）。這些結(jié)果證實(shí)了止痙散對(duì)于CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀的治療作用，且在用止痙散治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性（圖1e）。

2.2各組小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)結(jié)果在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過(guò)程中，許多免疫細(xì)胞和關(guān)節(jié)細(xì)胞被激活，引起炎癥［15］。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)止痙散對(duì)于CIA小鼠的治療作用，我們對(duì)小鼠的踝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)疾病相關(guān)炎癥因子的變化，結(jié)果表明給藥止痙散后可以降低CIA小鼠相關(guān)炎癥因子IL-2（Interleukin-2），IL-6（Interleukin-6）的變化，與正常組相比，模型組IL-2、IL-6水平顯著升高（P<0.005），與模型組相比，止痙散組IL-2（P<0.005）、IL-6（P<0.05）水平顯著降低，止痙散降低RA小鼠的炎癥反應(yīng)，延緩疾病的發(fā)生發(fā)展（見(jiàn)圖2）。

對(duì)破骨細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)給藥后關(guān)節(jié)部位OPG和RANKL蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響，但是卻減少了破骨細(xì)胞的數(shù)量（見(jiàn)圖3，P<0.0005）

2.3止痙散對(duì)RA小鼠腸道菌群組成的影響

2.3.1PCA分析PCA結(jié)果顯示止痙散顯著改善了直腸和盲腸部位的物種差異，但在結(jié)腸部位的改善效果并不明顯（見(jiàn)圖4a）。

2.3.2α多樣性分析α多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Chao1指數(shù)反映物種總數(shù)，結(jié)果顯示，在直腸中模型組的Chao1指數(shù)最高，物種總數(shù)最多，給藥后顯著降低了物種總數(shù)；Shannon指數(shù)顯示微生物的多樣性，值越大，群落多樣性越高結(jié)果顯示在直腸和盲腸中的模型組群落多樣性較高，給藥后群落多樣性降低，在直腸組中變化有顯著性差異；α多樣性結(jié)果提示腸道菌群在直腸部位的變化更顯著。（見(jiàn)圖4b）。

2.3.3小鼠腸道不同部位菌群組成取小鼠腸道不同部位菌群進(jìn)行16S檢測(cè)，在菌群組成上可以發(fā)現(xiàn)，直腸，盲腸部位的腸道組成基本一致，以厚壁菌門(mén)（firmicutes）為主，擬桿菌門(mén)（bacteroidetes）次之；而在結(jié)腸部位，以厚壁菌門(mén)（firmicutes）為主，其他菌種占比很小。在腸道菌群的組成上，直腸與盲腸部位無(wú)明顯差別，但結(jié)腸部位菌群組成與其明顯不同（見(jiàn)圖4c）。

2.4止痙散調(diào)控RA小鼠腸道差異菌群

2.4.1基于門(mén)水平調(diào)控小鼠腸道菌群分析基于門(mén)水平菌群差異分析檢測(cè)，在門(mén)水平上，直腸部位厚壁菌門(mén)（firmicutes），大腸桿菌門(mén)（epsilonbacteraeota），變形菌門(mén)（proteobacteria）等在給藥后都比模型組相比有降低；而擬桿菌門(mén)（bacteroidetes）和放線菌門(mén)（actinobacteria）在給藥后有所升高；在盲腸中的菌群變化與直腸有所不同，盲腸中的厚壁菌門(mén)，擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)的變化與直腸相反；而結(jié)腸中的菌群因變化不明顯不具有討論意義，因此不做討論。結(jié)果顯示止痙散改變了小鼠腸道不同部位的菌群，但是在門(mén)水平上直腸和盲腸的菌群變化有所不同（見(jiàn)圖5a）。

2.4.2基于屬水平調(diào)控小鼠腸道菌群分析在屬水平上，直腸和盲腸內(nèi)容物在毛螺菌（lachnospiraceae），乳桿菌（lactobacillus），螺桿菌（helicobacter），理研菌（rikenella），Alistipes，Muribaculum，Muribaculaceae等屬種上有明顯變化，其中Muribaculum，螺桿菌（helicobacter），毛螺菌（lachnospiraceae）等屬種是文獻(xiàn)報(bào)道的與RA疾病相關(guān)的炎癥相關(guān)微生物，給藥止痙散后，止痙散組小鼠的這些炎癥相關(guān)微生物的水平被顯著降低了，且與正常組腸道微生物差異無(wú)二；而腸道益生菌乳酸菌（lactobacillus）增加了，證明止痙散改變了腸道菌群的豐度以及菌群種類(lèi)，改善了腸道微環(huán)境，對(duì)疾病產(chǎn)生有利影響（圖5b）。

2.5止痙散給藥過(guò)程中對(duì)ICR小鼠的毒性研究

2.5.1止痙散單日最大給藥劑量對(duì)ICR小鼠急性毒性的研究在急性毒性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，止痙散組小鼠的體重與正常組無(wú)明顯差異，且在穩(wěn)步增長(zhǎng)（見(jiàn)圖6a）。檢測(cè)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、尿素氮（BUN）、血肌酐（CRE）的水平，并對(duì)心、肝、肺、腎部位進(jìn)行組織病理檢測(cè)。結(jié)果提示，每日按16 g/kg（相當(dāng)于人臨床給藥劑量的960倍）的劑量給藥對(duì)小鼠血液生化學(xué)指標(biāo)及臟器病理無(wú)明顯影響（見(jiàn)圖6b，圖6c）。

2.5.2止痙散人等效給藥量對(duì)ICR小鼠的影響給藥期間正常組和止痙散給藥組小鼠的活動(dòng)狀態(tài)正常，在給藥第3周時(shí)止痙散組小鼠體重與正常組小鼠比較，止痙散明顯延緩了小鼠體重增長(zhǎng)，但在第四周止痙散組與正常組體重?zé)o明顯差異（見(jiàn)圖7a）。各小鼠的血液生化學(xué)指標(biāo)及主要臟器病理檢測(cè)（心、肝、肺、腎）無(wú)明顯異常改變，說(shuō)明止痙散給藥過(guò)程中對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性（圖7b，7c）。

3討論

RA是以炎癥、滑膜增生，關(guān)節(jié)骨破壞為主要表征的自身免疫性疾病，口服西藥是目前治療RA的首選方法。但RA的治療療程長(zhǎng)，長(zhǎng)期服用西藥可能出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、造血系統(tǒng)和肝腎功能損害等副作用，停藥后復(fù)發(fā)也是目前西藥治療RA的又一痛點(diǎn)。止痙散由全蝎和蜈蚣等比例組成，《秘驗(yàn)奇珍》中記載止痙散可以治療關(guān)節(jié)痛，中風(fēng)后遺癥等。我們前期證明止痙散可以緩解RA小鼠的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。在本次研究中，為了確保止痙散使用過(guò)程中的安全性，我們對(duì)給藥后的CIA小鼠進(jìn)行了臟器的病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示，各臟器無(wú)明顯毒性。為了進(jìn)一步研究止痙散是否有毒性，我們使用ICR小鼠進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)了臟器病理以及血生化，結(jié)果顯示，給藥過(guò)程中無(wú)明顯毒性。

有研究表明細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等，

通過(guò)介導(dǎo)多條信號(hào)通路在 RA 疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，炎性因子介導(dǎo)的體液免疫機(jī)制是RA炎性反應(yīng)的重要因素［16］。在RA的發(fā)生發(fā)展中，破骨細(xì)胞過(guò)度分化，成骨細(xì)胞被抑制，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的失衡是RA發(fā)展的關(guān)鍵因素，OPG是破骨細(xì)胞抑制因子，Trap是破骨細(xì)胞標(biāo)記酶，RankL可激活破骨細(xì)胞，Runx-2 基因主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中，是調(diào)控骨形成和骨骼肌功能的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，Runx-2 參與調(diào)控成骨細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化［17-20］。本次研究發(fā)現(xiàn)，止痙散可以降低CIA小鼠相關(guān)炎癥因子IL-2、IL-6的水平，減輕RA小鼠的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，給藥后關(guān)節(jié)部位OPG和RANKL蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響，但破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，這與我們之前的研究結(jié)果一致［5］，止痙散可能是通過(guò)Rankl的下游通路發(fā)揮作用。

中藥大多經(jīng)口給藥并經(jīng)過(guò)胃腸消化吸收，這一過(guò)程有可能影響和調(diào)控體內(nèi)腸道菌群，發(fā)揮腸相關(guān)淋巴組織乃至全身的免疫調(diào)節(jié)作用，這可能是其發(fā)揮藥理作用的機(jī)制之一［21］。近來(lái)研究表明，腸道微生態(tài)菌群失調(diào)是RA發(fā)生及發(fā)展的重要因素。Pedrogo D a M等提出，腸道微生態(tài)菌群失調(diào)會(huì)增加腸道上皮細(xì)胞及黏膜的通透性，損傷腸上皮細(xì)胞的保護(hù)屏障，導(dǎo)致腸道中某些病原微生物及其促炎代謝物進(jìn)入血液循環(huán)后不斷聚集于關(guān)節(jié)處，最終引發(fā)炎癥。也有研究表明，腸道菌群失調(diào)可能通過(guò)導(dǎo)致Th17-Treg失衡或tfh細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)誘發(fā)RA［22-25］。另外有報(bào)道稱，隨著關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，CIA易感小鼠的腸道菌群多樣性指數(shù)明顯高于正常小鼠［26］。本次研究結(jié)果顯示，直腸區(qū)域模型組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)較高，物種總數(shù)多，群落多樣性高，止痙散能顯著降低直腸部位腸道菌群的物種總數(shù)和群落多樣性。結(jié)腸的Chao1指數(shù)比直腸和盲腸腸段低，且菌群的分析結(jié)果也顯示在門(mén)和屬的水平上結(jié)腸的差異菌群種類(lèi)較少，沒(méi)有代表意義，因此不再討論結(jié)腸菌群的變化水平。擬桿菌門(mén)具有維持腸道菌群平衡的作用［27］，在給藥止痙散后，直腸部位擬桿菌（bacteroidetes）的水平升高，有助于恢復(fù)腸道菌群的平衡狀態(tài)；盲腸部位擬桿菌（bacteroidetes）的水平與其相反，產(chǎn)生差異的原因需要進(jìn)行深入探討。

研究表明，某些致病菌會(huì)加重RA的反應(yīng)，同時(shí)，隨著RA的發(fā)展，腸道中的某些菌群的相對(duì)豐度也會(huì)發(fā)生改變。Ebrahimi等［28］發(fā)現(xiàn)感染H.pylori（螺桿菌屬）的RA患者的C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)的檢測(cè)水平、DAS-28和VAS評(píng)分明顯高于未感染H.pylori的RA患者。同時(shí)，研究人員通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)［29］，隨著RA患者病情加重，RA患者腸道中擬桿菌屬（muribaculaceae）顯著減少，毛螺菌（lachnospiraceae）、螺桿菌（helicobacter）顯著增加。本研究中，CIA小鼠直腸和盲腸部分的毛螺菌和螺桿菌的相對(duì)豐度升高，擬桿菌屬的相對(duì)豐度降低，止痙散給藥后，上述菌群的改變被逆轉(zhuǎn)并恢復(fù)至與正常水平接近。大量的研究表明口服乳桿菌等益生菌，能夠緩解類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)［9］。本研究中，給予0.18 g/kg止痙散后，小鼠直腸和盲腸部位乳桿菌（lactobacillus）的水平明顯升高，并高于正常組。因此，我們認(rèn)為止痙散可能通過(guò)改善腸道菌群失調(diào)、提高益生菌豐度降低RA炎癥反應(yīng)，阻止RA進(jìn)一步發(fā)展。

基于此，本研究從腸道菌群出發(fā)，研究止痙散對(duì)CIA小鼠腸道菌群的變化的影響，并從小鼠腸道的不同部位出發(fā)，闡明止痙散治療RA的作用機(jī)制（見(jiàn)圖8）。

4結(jié)論

止痙散是《秘驗(yàn)奇珍》中的驗(yàn)方，由全蝎和蜈蚣兩味蟲(chóng)類(lèi)藥組成，全蝎和蜈蚣都屬于走竄類(lèi)中藥，全蝎活絡(luò)止痛，攻毒散結(jié)，用于治療關(guān)節(jié)痹痛功效較佳；蜈蚣為熄風(fēng)止痙要藥，對(duì)于治驚癇抽搐，破傷風(fēng)等癥均有良效［30］。

本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的CIA小鼠進(jìn)行造模給藥，給藥之后發(fā)現(xiàn)止痙散組與正常組相比體重?zé)o明顯差異；CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)畸形情況與模型組相比顯著減輕；且給藥組的炎癥因子的水平顯著降低，止痙散組的破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞相關(guān)因子都有改善，從而改善RA的關(guān)鍵癥狀。

此外，在給藥之后，止痙散組的腸道菌群的豐度與模型組相比也有差異。在用16SrRNA進(jìn)行腸道內(nèi)容物測(cè)序之后，發(fā)現(xiàn)其菌群在直腸與盲腸部位發(fā)生顯著變化，如文獻(xiàn)報(bào)道的炎癥相關(guān)微生物螺桿菌（helicobacter），毛螺菌（lachnospiraceae）等在給藥治療之后其豐度顯著降低了，而乳酸菌（lactobacillus）的含量升高了，證明止痙散給藥降低了全身炎癥反應(yīng)，提高了益生菌的含量，對(duì)RA產(chǎn)生治療作用，且在治療過(guò)程中無(wú)明顯毒副作用。但是，本次實(shí)驗(yàn)納入樣本量較小，后期研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本、結(jié)合代謝組學(xué)對(duì)止痙散改善腸道菌群治療RA的機(jī)制做更深入的探討。

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