基于生物信息學(xué)分析TUBG1基因在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值

侯沅林，劉潔蘭，李鈺穎，盧詩(shī)麗，胡婷，莫麗梅，唐玉蓮，2

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院；2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000）

肝細(xì)胞肝癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是世界上最常見(jiàn)的致命惡性腫瘤，在我國(guó)LI?HC已成為惡性腫瘤的第二大病因，每年死于LIHC的人數(shù)位列全球第一，對(duì)人類(lèi)健康威脅極大［1］。微管蛋白γ1（Tubulin gamma 1，TUBG1）基因?yàn)榫幋a微管蛋白超家族的一個(gè)成員，該基因位于染色體17q21.2。TUBG1基因編碼的蛋白質(zhì)定位于中心體，在中心體上與微管結(jié)合，作為γ微管蛋白復(fù)合物的一部分。該蛋白介導(dǎo)微管成核，在微管細(xì)胞骨架的組織中起核心作用，是微管形成和細(xì)胞周期進(jìn)展所必需的。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，TUBG1基因與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤以及皮質(zhì)發(fā)育畸形的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［2-6］。TUBG1基因可促進(jìn)微管聚合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞紡錘體形成，加速腫瘤細(xì)胞分裂進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。因此，TUBG1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分。目前，關(guān)于TUBG1基因在LIHC中的表達(dá)與預(yù)后尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)探討TUBG1基因在LIHC中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值，為干預(yù)治療LIHC提供靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 分析TUBG1基因在不同腫瘤組織中的表達(dá)利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析TUBG1基因在不同腫瘤組織中的表達(dá)。選擇TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)下的“Exploration”模塊，點(diǎn)擊“Gene-DE”，輸入基因“TUBG1”，點(diǎn)擊“Submit”，檢索出TUBG1基因在不同腫瘤組織及其正常組織中的表達(dá)。

1.2 分析TUBG1基因在LIHC和正常對(duì)照組織中的差異表達(dá) 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TUBG1基因在LIHC和正常對(duì)照組中的表達(dá)情況，并利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)驗(yàn)證。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)選擇“Cancer Type Analysis”模塊，再點(diǎn)擊“Differential genes analysis ”選項(xiàng)選擇腫瘤名稱(chēng)進(jìn)行分析。其次，在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的“Single Gene Analysis”模塊下，選擇“Boxplots”選項(xiàng)，輸入基因名稱(chēng)和腫瘤名稱(chēng)進(jìn)行差異表達(dá)分析，其結(jié)果以箱式圖呈現(xiàn)。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)頁(yè)面點(diǎn)擊“TCGA”模塊，輸入基因名稱(chēng)并選擇腫瘤名稱(chēng)，在“Expression”模塊下選擇樣本類(lèi)型，檢索出TUBG1基因在LIHC（n=371）與正常對(duì)照組（n=50）中的差異表達(dá)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置|log2FC| Cutoff為1、p-value Cutoff 為0.01，為差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，分析TUBG1基因在369例肝癌樣本和160例正常樣本中的差異表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3 分析TUBG1基因與臨床病理特征的相關(guān)性基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)“Expression”模塊下，逐一選擇腫瘤分期、患者種族、性別、年齡、體重、腫瘤分級(jí)進(jìn)行分析。

1.4 分析TUBG1基因表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的“Survival”模塊輸入基因和腫瘤名稱(chēng)，高低表達(dá)組以中位值進(jìn)行分組，分析TUBG1基因?qū)IHC患者總生存期（Overall survival，OS）和無(wú)病生存期（Disease free survival，RFS）的影響。

1.5 TUBG1與互作蛋白的相關(guān)性分析以及功能富集分析 經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，在線(xiàn)檢索出與TUBG1有緊密關(guān)系的蛋白，并進(jìn)行功能富集分析。檢索參數(shù)設(shè)置：最高可信度設(shè)置為0.7，最大交互數(shù)設(shè)置為20，其余參數(shù)為默認(rèn)。TUBG1及其相關(guān)基因利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Wilcoxon檢驗(yàn)分析TUBG1基因在不同腫瘤組織和相鄰正常組織中的表達(dá)；使用單因素方差分析TUBG1基因在肝細(xì)胞肝癌組織與正常對(duì)照組織中的表達(dá)；采用Logrank檢驗(yàn)分析TUBG1基因高、低表達(dá)組的生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TUBG1基因在不同腫瘤組織中的表達(dá)TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，TUBG1基因除在少數(shù)癌癥組織中低表達(dá)外，在包括LIHC的多種癌癥中高表達(dá)（圖1）。

圖1 TUBG1基因在不同腫瘤組織和相鄰正常組織中的差異表達(dá)

2.2TUBG1基因在LIHC組織和正常對(duì)照組織中的差異表達(dá) GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)均顯示，TUBG1基因在LIHC中的表達(dá)高于在正常對(duì)照組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 TUBG1基因在LIHC和正常組織中的差異表達(dá)

2.3TUBG1基因與臨床特征的相關(guān)性 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，與正常對(duì)照組相比，TUBG1的表達(dá)量與腫瘤分期、患者種族、性別、年齡、體重、腫瘤分級(jí)有關(guān)（P均＜0.05），Ⅳ期患者的組別除外（P＞0.05）；在Ⅲ期肝癌患者中，TUBG1的表達(dá)水平較Ⅰ期肝癌患者升高（P＜0.05）；TUBG1在亞洲人種患者中的表達(dá)量高于白種人（P＜0.05）；正常體重患者TUBG1的表達(dá)量高于極重患者（P＜0.05）；腫瘤3級(jí)中TUBG1的表達(dá)水平高于腫瘤2級(jí)（P＜0.05）（圖3）。

圖3 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中TUBG1在不同臨床病理特征中的差異表達(dá)

2.4TUBG1基因表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TUBG1基因與臨床預(yù)后的關(guān)系，以中位值對(duì)高低表達(dá)患者進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，在肝細(xì)胞肝癌患者中TUBG1高表達(dá)者的總生存率和無(wú)病生存率均低于低表達(dá)者（P＜0.05）（圖4）。

圖4 TUBG1表達(dá)與LIHC患者預(yù)后的關(guān)系

2.5TUBG1基因其編碼蛋白與互作蛋白的相關(guān)性分析以及功能富集分析 經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出NINL、RLK1、HAUS6、BRCA1、CDK5RAP2、NEDD1、MZT1、PLK4、TUBGCP3、MZT2A、CENPJ、NME7、TUBGCP6、TUBGCP5、MZT2B、RPGR、TUBG2、TUBGCP2、TUBGCP3、ACTG1共20個(gè)與TUBG1存在緊密關(guān)系的蛋白（圖5）。將他們經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)功能富集分析發(fā)現(xiàn)，他們主要參與微管成核、微管細(xì)胞骨架組織、有絲分裂細(xì)胞間期等過(guò)程；具有蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)成分等分子功能；涉及γ微管蛋白復(fù)合物、中心體、紡錘體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)等細(xì)胞組分（表1）。

表1 TUBG1及其相關(guān)基因功能富集分析

圖5 LIHC中TUBG1的互作蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

腫瘤細(xì)胞通過(guò)無(wú)限的有絲分裂大量增殖，而有絲分裂的過(guò)程需依靠中心體、紡錘體參與以及微管有序的動(dòng)態(tài)變化。微管蛋白γ1是編碼微管蛋白超家族的一個(gè)成員，是有絲分裂中心體形成的關(guān)鍵蛋白。該蛋白介導(dǎo)微管成核、參與有絲分裂紡錘體組裝以及中心體復(fù)制，在微管細(xì)胞骨架的組織中起核心作用，是微管形成和細(xì)胞周期進(jìn)展所必需的。因此，微管蛋白γ1在腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，微管是一種動(dòng)態(tài)的絲狀細(xì)胞骨架蛋白，也是中心粒的主體分子，微管纖維的有序性是細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的重要保證［7］。鄒翔等［8］發(fā)現(xiàn)，使用微管抑制劑能起到抗腫瘤的作用，其機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)或抑制微管的聚合破壞微管的動(dòng)態(tài)平衡，阻礙腫瘤細(xì)胞紡錘體形成，阻滯細(xì)胞分裂進(jìn)程，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。VINOPAL S等［9］發(fā)現(xiàn)，在人骨肉瘤細(xì)胞(Human osteosarcoma cell，U2OS)中，通過(guò)RNAi耗竭微管蛋白γ1可導(dǎo)致微管成核受損和中期阻滯。CORVAISIER M等［10］研究發(fā)現(xiàn)，γ微管蛋白位置的改變可確保細(xì)胞存活并保持基因組完整性，且有助于增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）向細(xì)胞質(zhì)募集，通過(guò)這種機(jī)制，γ微管蛋白網(wǎng)絡(luò)通過(guò)充當(dāng)PCNA從胞漿運(yùn)輸?shù)饺旧|(zhì)的支架維持腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖。TUBG1不僅在各種癌癥中有所表達(dá)，也能導(dǎo)致微管病的發(fā)生。YUEN Y T K等［11］發(fā)現(xiàn)，負(fù)責(zé)細(xì)胞微管的TUBG1如果發(fā)生突變，其編碼的微管蛋白突變會(huì)引起大腦異常、小頭畸形、早發(fā)性癲癇和運(yùn)動(dòng)障礙。由此可見(jiàn)，TUBG1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具有十分重要的研究?jī)r(jià)值。

與TUBG1有緊密關(guān)系的RLK1、CDK5RAP2、NEDD1等20個(gè)蛋白，經(jīng)過(guò)功能富集分析發(fā)現(xiàn)，他們共同參與了微管成核、微管細(xì)胞骨架組織、有絲分裂細(xì)胞間期等過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn)，PLK1經(jīng)過(guò)反義寡核苷酸處理后可抑制PLK1表達(dá)，轉(zhuǎn)染PLK1反義寡核苷酸的細(xì)胞中心體模糊、擴(kuò)大，這提示可能出現(xiàn)了γ微管蛋白的解聚和中心體的解體，說(shuō)明PLK1的表達(dá)會(huì)影響γ微管蛋白合成中心體［12］。有研究報(bào)道稱(chēng)，微管成核需要γ微管蛋白及其招募蛋白GCP-WD/NEED1和CDK5RAP2，他們將γ微管蛋白錨定在中心體上［13］。另外，NEED1被發(fā)現(xiàn)其與γ微管蛋白復(fù)合體的成分組合，并以該復(fù)合體為目標(biāo)，進(jìn)而與中心體和紡錘體相結(jié)合［14］。NEED1缺失會(huì)導(dǎo)致中心體γ微管蛋白環(huán)復(fù)合體丟失，并導(dǎo)致微管成核和紡錘體組件失敗。可見(jiàn)這些基因都與微管、中心體、紡錘體的合成有關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的有絲分裂。在肝細(xì)胞肝癌中，我們發(fā)現(xiàn)了他們也與TUBG1密切相關(guān)，且都是正相關(guān)。因此，TUBG1基因在肝細(xì)胞肝癌組織中的高表達(dá)可能是他們共同作用的結(jié)果。TUBG1在不同腫瘤和疾病中的作用機(jī)制不相同，基于本文的數(shù)據(jù)可以看出，TUBG1與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展有一定聯(lián)系，但其具體作用機(jī)制還不清楚，仍需深度地進(jìn)行研究。

綜上所述，TUBG1在肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)。TUBG1與腫瘤分期、患者種族、性別、年齡、體重、腫瘤分級(jí)密切相關(guān)（P均＜0.05）；且生存分析表明，在肝細(xì)胞肝癌患者中，TUBG1高表達(dá)者總生存率和無(wú)病生存率均低于低表達(dá)者（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，高表達(dá)的TUBG1可能是肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的不良因素；另外，RLK1、CDK5RAP2、NEDD1與TUBG1密切相關(guān)，TUBG1基因在肝細(xì)胞肝癌組織中的高表達(dá)可能是他們共同作用的結(jié)果。本文可為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制提供思路。