馬齒莧多糖抗CCl4誘導(dǎo)的小鼠慢性肝纖維化作用

李小花，曹性玲，劉四君，曹思，鐘桂香，黎曉，吳麗珍

（1.贛南醫(yī)學(xué)院資產(chǎn)管理處；2.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；4.贛南醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，江西 贛州 341000）

肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞發(fā)生持續(xù)、反復(fù)的壞死或炎癥刺激，大量纖維增生同時伴有纖維降解的相對或絕對不足，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix， ECM）在肝內(nèi)大量沉積并演變?yōu)楦斡不?-3］，最終發(fā)展為肝癌。近年來研究發(fā)現(xiàn)人和動物肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的可能性［4-5］，而肝癌是不可以逆轉(zhuǎn)的，治療非常困難，因而抓住治療關(guān)鍵期，干預(yù)和逆轉(zhuǎn)肝纖維化是預(yù)防肝癌發(fā)生的重要途徑。目前肝纖維化有效治療藥物非常有限，西藥治療效果不佳，且不良反應(yīng)大；中藥溫和不良反應(yīng)小，近年來大力提倡開發(fā)中藥潛力。

馬齒莧為馬齒莧科馬齒屬草本植物，已收入《中華人民共和國藥典》，藥典記載其味酸性寒，歸肝，大腸經(jīng)，具有清熱解毒，涼血止血的效果。馬齒莧的主要成分是生物堿、多糖、黃酮等，其中多糖類是有效活性成分之一，具有抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂、抗氧化、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、延緩衰老、鎮(zhèn)痛、減輕心肌缺血再灌注損傷等作用［6-13］。馬齒莧提取物對輻射、藥物、四氯化碳（CCl4）所致的急慢性肝損傷具有保護作用［14-15］，此外，研究還發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖（Purslane Polysaccharide， POP）通過干擾氧化功能、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗癌作用［16］。以上證據(jù)表明，POP可能逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進展。本研究擬采用CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，明確POP是否逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進展，并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級昆明小鼠72只，鼠齡8 W，體質(zhì)量20～25 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（粵）2016-0041。小鼠自由進食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～20 ℃，相對濕度50%～60%，自由光照，持續(xù)通風(fēng)換氣。

1.2 藥物與試劑 馬齒莧多糖粉劑購自扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司（批號：SNT200518），純度為50%。聯(lián)苯雙酯（Dimethyl diphenyl bicarboxylate，DDB，國藥準(zhǔn)字H32026034）購自江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司。PBS磷酸鉀緩沖液（Hyclone，批號：SH30256.01B）。HE染液套裝試劑盒購自于博奧森生物科技有限公司。引物合成（北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）。α-平滑肌動蛋白（Alpha smooth muscle actin， α-SMA）一抗（ab5694）購自Abcam公司。GAPDH一抗（MA515738）和羊抗兔二抗（SA24591）購自Thermo Fisher公司。小鼠透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid， HA）（FT-P9S1081X）和層黏連蛋白（Laminin， LN）（FT-P9S633X）ELISA試劑盒購自上海梵態(tài)生物科技有限公司。Ⅲ型前膠原-N（Procollagen type Ⅲ-N， PⅢNP）（CS-E02451）ELISA試劑盒購自上海莼試生物技術(shù)有限公司。電鏡固定液購自Servicebio公司（G1102）。高效RIPA組織快速裂解液（R0010）、PMSF（10 mM， P0100）、30%丙烯酰胺（A1010）、Tris（T8060）、甘氨酸（G8200）、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， SDS， S8010）和5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液（含DTT）（P10）40均購自Solarbio公司。BCA試劑盒（WB319945）Prestained Protein Ladder（011113447） 、PVDF膜（88520）、增強化學(xué)發(fā)光試劑（WC323101）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（00762290）均購自Thermo Fisher公司。

1.3 儀器 透射電子顯微鏡（hitachi， HT7800/HT7700），鉆石切片刀（Daitome， Ultra 45°），超薄切片機（Leica， Leica UC7）。核酸蛋白測定儀（BioPhotometer plus， 艾本德），流式細(xì)胞儀（BD calibur），酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific， multiscan MK3），倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CKX41， UCTR30-2），定量PCR（Invitrogen公司，ABI PRISM?7500 Sequence Detection System）。

1.4 方法

1.4.1 建立肝纖維化模型及給藥 SPF級雄性昆明小鼠，隨機分成6組：對照組、模型組、DDB（2.5 mg·kg-1）組、低劑量（25 mg·kg-1） POP組、中劑量（50 mg·kg-1）POP組、高劑量（100 mg·kg-1）POP組，每組12只。采用10% CCl4橄欖油溶液制作小鼠病理模型，除對照組外均以10 mL·g-1體重腹腔注射10% CCl4油溶液，對照組注射等體積的橄欖油，每周2次，連續(xù)6周。造模同時，各組小鼠分別給予生理鹽水、DDB（0.25 mg·mL-1）、POP（2.5、5、10 mg·mL-1）灌胃，體積為10 mL·kg-1體重，如遇到需要腹腔注射CCL4的當(dāng)天，間歇30～60 min后灌胃，持續(xù)6周。

1.4.2 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 小鼠給藥6 W后，1%濃度的戊巴比妥鈉按5 mL·kg-1劑量腹腔注射，動物麻醉后處死，取5 mm×5 mm×5 mm肝組織，10%甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，400倍顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 電鏡觀察 取1 mm×1 mm×1 mm肝組織，經(jīng)固定、脫水和包埋，樹脂塊于超薄切片機60～80 nm切片，150目銅網(wǎng)撈片。2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水洗3次，濾紙稍吸干，切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析結(jié)果。

1.5 ELISA檢測 小鼠內(nèi)眥取血，3 000×g離心5 min，取血清于-80 ℃凍存。準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。按照試劑盒說明操作，在30 min之內(nèi)，酶標(biāo)儀測量405 nM波長范圍吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算目標(biāo)蛋白含量。

1.6 qPCR 檢測 取各組小鼠肝組織約20 mg，提取總RNA，用Oligo dT反轉(zhuǎn)錄，采用博奧森生物科技有限公司購置的PCR試劑盒擴增，引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列如表1。采用相對定量法檢測小鼠肝臟組織中ColLAGEN Ⅲ、Smad4、TGF-β1和ɑ-SMA的mRNA表達水平，以18sRNA為內(nèi)參，運用2-ΔΔCT方法計算各組mRNA的相對表達含量。qPCR擴增體系為20 μL，包括2x SYBR Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，基因組DNA（1∶20稀釋）5.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件和溶解曲線分析參考試劑盒說明書設(shè)定溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

表1 檢測基因引物序列表

1.7 Western blotting 檢測 取各組小鼠肝組織約50 mg，用含有PMSF的高效RIPA裂解提取總蛋白，BCA方法行蛋白定量。將等量（約20 μg）的總蛋白加入到10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，然后將膠中的蛋白在Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，與GAPDH（1∶1 000）、或α-SMA（1∶1 000）一抗孵育，4 ℃過夜。山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h。將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的兩種試劑按1∶1比例混合，與PVDF膜孵育1 min，AI600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對條帶進行檢測及分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各測量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析與多重比較相結(jié)合方法，組間各測定指標(biāo)的總體比較用單因素方差分析，Tukey檢驗對組內(nèi)各指標(biāo)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索狀排列分布呈放射狀，未見細(xì)胞空泡樣變性及炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠可見肝細(xì)胞水腫及空泡樣變性，炎癥反應(yīng)明顯，可見較多炎癥細(xì)胞，核深染，少量纖維化增生；DDB組與POP高劑量組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，見少量空泡樣變性及壞死細(xì)胞，炎癥反應(yīng)不明顯，少見炎癥細(xì)胞。POP低、中劑量給藥組小鼠肝損傷與模型組相比均有不同程度改善，部分可見細(xì)胞水腫變性，散在少許炎性細(xì)胞浸潤。POP給藥各組病理改變均比模型組有所減輕，表現(xiàn)出隨劑量作用增強的趨勢（圖1）。

圖1 小鼠肝組織病理變化（HE×400）

2.2 肝組織形態(tài)學(xué)改變電鏡結(jié)果 對照組血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，結(jié)構(gòu)清晰，線粒體飽滿，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)豐富。模型組結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞核增大，常染色質(zhì)數(shù)量異常增加，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器代償性增多，脊增多或斷裂，有少許空泡，DDB組細(xì)胞核呈卵圓形，核膜正常厚度，可見均勻分布的染色質(zhì)，胞漿內(nèi)線粒體較多。隨著POP給藥濃度梯度增大，各給藥組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)漸變清晰，細(xì)胞核及線粒體等細(xì)胞器大小趨向正常，核染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)有少量膠原存在，且上述狀態(tài)均較模型組減輕（圖2）。

圖2 小鼠肝組織細(xì)胞電鏡特征（×2 000）

2.3 馬齒莧多糖對小鼠肝纖維化相關(guān)基因表達的影響 慢性肝纖維化模型組小鼠肝組織CollagenⅢ、ɑ-SMA、TGF-β1和Smad4 mRNA表達水平增高；POP治療組上述基因表達呈劑量依賴性下降，以高劑量效果最好（圖3）。

圖3 馬齒莧多糖對小鼠慢性肝纖維化相關(guān)基因表達的影響

2.4 馬齒莧多糖對小鼠肝纖維化相關(guān)蛋白表達的影響 模型組血清肝纖維化相關(guān)蛋白LN、HA和PⅢNP顯著提高，提示肝纖維化模型造模成功，POP給藥組HA、LN、PⅢNP均顯示劑量依賴性下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組α-SMA表達水平明顯增高，POP給藥組α-SMA表達明顯下降（圖4）。

圖4 馬齒莧多糖對小鼠慢性肝纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

研究已證實，去除損傷因素并進行保肝治療后，肝纖維化具有可逆性［17］，為進一步研究肝纖維化藥物治療提供了重要的理論依據(jù)。本研究采用CCl4建立小鼠慢性肝纖維化病理模型，模型組小鼠形態(tài)學(xué)與電鏡結(jié)構(gòu)改變均提示造模成功。POP不同劑量給藥組病理形態(tài)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到改善，與纖維化相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子的下調(diào)呈現(xiàn)規(guī)律相關(guān)性，表明POP對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)效果，為揭示POP抗纖維化機制研究提供了依據(jù)。

肝纖維化形成的主要原因已經(jīng)證實與Ⅰ、Ⅲ型膠原在肝組織沉積有關(guān)［18］，故大多數(shù)藥物的作用原理通過降解膠原蛋白減輕肝纖維化，促進肝細(xì)胞再生實現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，POP治療組Collagen Ⅲ的mRNA呈濃度依賴降低，伴隨著肝組織形態(tài)學(xué)炎癥病理的好轉(zhuǎn)，電鏡下細(xì)胞線粒體與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)逐步恢復(fù)，提示POP可能通過降低膠原蛋白異常沉積達到抗纖維化作用，與安禎祥等［19］研究機制吻合。

慢性肝纖維化表現(xiàn)為組織異常增生和肝星狀細(xì)胞活化并分泌膠原蛋白、HA、LN、PIIINP為特征［20］，同時伴肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA的mRNA和蛋白表達升高［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，POP治療組肝組織HA、LN、PⅢNP含量降低，提示其可抑制肝星狀細(xì)胞的活化；α-SMA的mRNA和蛋白水平均較模型組降低，提示POP可減慢成纖維細(xì)胞活化并逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

細(xì)胞因子對肝纖維化病理發(fā)生發(fā)展有重要影響，其中轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor，TGF）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子。TGF-β1為多功能簇蛋白多肽，是促纖維化作用始動因子，可促進肝細(xì)胞分泌膠原蛋白，加速激活肝星狀細(xì)胞的活化。TGF-β主要通過下游信號分子Smad通路的激活，參與肝纖維化的進展［22-24］，因此，減少TGF-β1和Smads表達可以改善肝纖維化［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，POP治療后，TGF-β1和Smad4 mRNA表達下調(diào)，提示POP的抗誘導(dǎo)的肝纖維化作用可能是通過抑制TGF-β/Smad信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，POP具有抗肝纖維化作用，其機制可能通過下調(diào)TGF-β/Smad信號通路，調(diào)控α-SMA及膠原蛋白表達，減少細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白沉積實現(xiàn)。