油茶肉質(zhì)果提取物的成分鑒定及抗結(jié)腸炎作用的研究

田洪波，卿芙蓉，謝韜，吳素珍，李林福，黃俊云，劉志平，

（1.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院炎癥與免疫中心；3.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；4.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000）

炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎癥，主要分為克羅恩?。–rohn's Disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）。前者累及消化道任何部位，表現(xiàn)為穿透性肉芽腫性炎癥；后者累及直腸近端及結(jié)腸黏膜，表現(xiàn)為潰瘍性炎癥。這兩種疾病嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。近年來，我國IBD發(fā)病率明顯上升［2］。因其高發(fā)病率及易癌變的特點(diǎn)，對(duì)IBD的研究非常必要。但I(xiàn)BD準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前廣泛認(rèn)為是腸上皮的完整性受損導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)對(duì)腸道菌群發(fā)生異常免疫應(yīng)答，造成過度的免疫應(yīng)答和炎癥［3］。

目前，臨床上主要應(yīng)用一些基礎(chǔ)的抗炎藥物如氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素和柳氮磺胺吡啶來治療IBD［4-6］，但療效一般，且在皮膚、血液、腎臟、肝臟、胰腺、胃腸道或神經(jīng)系統(tǒng)方面有不良反應(yīng)［7-10］。因此，尋找新的不良反應(yīng)小且療效高的藥物或輔助藥物很有必要，這也可以為研究IBD的發(fā)病機(jī)理提供新的手段。

油茶（Camellia oleifera Abel）為山茶科多年生常綠喬木，屬蟲媒異花授粉雙子葉植物，是世界四大木本油料植物之一［11］。油茶肉質(zhì)果（Camellia oleifera Abelfleshy fruit）是外擔(dān)菌（Exobasidium vexans Massee.）侵染油茶幼嫩果而形成的富有營養(yǎng)的中國南方傳統(tǒng)野生果［11-13］。但目前人們未對(duì)油茶肉質(zhì)果的使用引起重視。

研究顯示，油茶肉質(zhì)果提取物（Camellia oleifera Abelfleshy fruit extract， CFFE）中的多糖能夠誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝細(xì)胞生產(chǎn)胰島素，且能使肝臟中轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源盒基因（Pancreatic duodenal ho?meobox-1, PDX-1）的蛋白表達(dá)上調(diào)［14］。同時(shí)油茶肉質(zhì)果多糖通過降低肌酸、血尿素氮，促炎癥細(xì)胞因子和纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)保護(hù)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腎臟功能［15］。有研究顯示，CFFE可能通過清除體內(nèi)自由基及抗脂質(zhì)過氧化，減輕對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷從而降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性糖尿病的血糖，降糖效果與消渴丸相當(dāng)［16-17］。其次，CFFE也能明顯抑制小鼠移植性實(shí)體瘤生長(zhǎng)，抑瘤能力在已知20種抗癌蔬菜中排名第9，抑瘤率為54.19%［18］。通過急性毒性試驗(yàn)、微核實(shí)驗(yàn)和精子致畸實(shí)驗(yàn)證明，CFFE無毒、無致突變活性，且能顯著抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)［19］，提示CFFE在抗氧化抑菌方面發(fā)揮重要作用。結(jié)腸炎發(fā)病與氧化應(yīng)激和異常免疫反應(yīng)密切相關(guān)，但油茶肉質(zhì)果在結(jié)腸炎中的作用尚未見報(bào)道。我們推測(cè)CFFE存在多種抗炎化合物，能夠有效調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生，在腸道炎癥的預(yù)防和治療中起作用。

1 材料和方法

1.1 CFFE提取 油茶肉質(zhì)果在2016年清明節(jié)前后采集于江西省吉安市，并由贛南醫(yī)學(xué)院李加林副教授鑒定。樣本處理按照文獻(xiàn)［14-15］，將樣品清洗、干燥并且切成小塊，再用高速粉碎機(jī)將其磨成細(xì)粉。將研磨后的材料在室溫下溶解于蒸餾水，然后在（99±1） ℃下萃取2 h。離心提取物，收集上清液并在70 ℃減壓濃縮。用3倍體積的乙醇沉淀該溶液，并通過過濾收集沉淀物，將其重新溶解在蒸餾水中。用Sevage法去除蛋白質(zhì)后，將提取物溶液用蒸餾水充分透析并冷凍干燥，然后將油茶肉質(zhì)果的提取物在-20 ℃下保存用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS） 將油茶肉質(zhì)果的提取物以1.0 mg·mL-1溶解在80%甲醇水溶液中，用于LC-MS分析。液相色譜分離（HPLC）采用Ultimate 3000液相色譜儀（Thermofisher）進(jìn)行。色譜條件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：10 ℃。梯度洗脫條件：0～60 min，5%～95%流動(dòng)相B乙腈。質(zhì)譜條件ESI離子源，正離子檢測(cè)模式下噴霧電壓：3.2 KV，負(fù)離子檢測(cè)模式下噴霧電壓：2.8 KV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；保護(hù)氣體流速：30 L·min-1；輔助氣體流速：10 L·min-1；掃描模式：Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍：100～1 500 m/z，階梯碰撞能量：20、40、60 V。

1.3 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 健康C57BL/6小鼠由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，6～7周齡，飼養(yǎng)在贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究評(píng)價(jià)了CFFE對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的影響。首先將小鼠隨機(jī)分為4組。除對(duì)照（Control）組外，其余各組均于第21天在飲水中加入3% DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎。由于收集的油茶肉質(zhì)果提取物數(shù)量有限，藥物組只設(shè)了高劑量組和低劑量組。實(shí)驗(yàn)小鼠分組：⑴Control組，無處理，正常飼養(yǎng)28天；⑵PBS+DSS組（每日灌胃PBS，連續(xù)21天，之后開始在飲水中加入3% DSS）；⑶CFFE-H+DSS組［每日灌胃0.05 mL·（10 g）-1CFFE，連續(xù)21天，之后開始飲水中加入3% DSS］；⑷CFFE-L+DSS組［每日灌胃0.025 mL·（10 g）-1CFFE，連續(xù)21天，之后開始在飲水中加入3%DSS］。實(shí)驗(yàn)過程中記錄小鼠體重變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（第28天）處死小鼠，收集結(jié)腸樣本，測(cè)定結(jié)腸長(zhǎng)度。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 使用Trizol（Invitrogen）從結(jié)腸組織中提取總RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Japan）合成cDNA。再用熒光定量PCR檢測(cè)β肌動(dòng)蛋白（Actb）、白細(xì)胞介素-6（Il-6）、腫瘤壞死因子-ɑ（Tnf）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和角質(zhì)細(xì)胞趨化因子（KC）的mRNA表達(dá)水平。PCR循環(huán)包括95 ℃變性5 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)量。用于PCR分析的引物序列如表1。

表1 小鼠RT-qPCR引物序列表

1.5 ELISA分析 收集結(jié)腸樣本，按照Mouse IL-6（Interleukin 6）ELISA Kit和Mouse TNF-α（Tumor Necrosis Factor alpha） ELISA Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，武漢）要求處理樣本，測(cè)定IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平。

1.6 Western-blot分析 結(jié)腸組織在含有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的蛋白裂解液中勻漿，12 000 rpm離心30 min收集上清。用BCA法測(cè)蛋白上清濃度。20 ng蛋白樣品于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，25 V轉(zhuǎn)膜25 min。之后放入5%的脫脂奶粉中37 ℃封閉1 h，加入IκB、p-IκB、p38、p-p38、Erk、p-Erk、Jnk和p-Jnk一抗（1∶1 000，CST，UK）和內(nèi)參抗體β-actin（1∶8 000，Sigma），4 ℃孵育過夜，漂洗，加二抗室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液（Thermo Fisher，USA）曝光顯示條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），Post-hoc測(cè)試使用Dunnett's test檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFFE的成分分析 首先，對(duì)提取得到的CFFE進(jìn)行LC-MS分析，然后將得到的數(shù)據(jù)在mzVault、chemspider及mzCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)檢索，確定CFFE的主要成分。其中包括已知的多種抗炎化合物，如茶多酚（圖1A和1B），山柰酚（圖1C和1D）和槲皮素（圖1E和1F）等。

圖1 LC-MS鑒定CFFE的成分

2.2 CFFE灌胃預(yù)防小鼠結(jié)腸炎作用 與Control組相比，PBS+DSS組在DSS處理后第5天體重開始出現(xiàn)顯著性下降，并在第8天體重下降14.8%，與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組體重下降程度明顯減輕，而CFFE-L+DSS組體重下降程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）。在結(jié)腸長(zhǎng)度方面，與Control組相比，PBS+DSS組結(jié)腸縮短程度顯著下調(diào)，與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組和CFFE-L+DSS組結(jié)腸長(zhǎng)度顯著性增加（圖2B）。通過對(duì)結(jié)腸外觀的觀察發(fā)現(xiàn)Control組結(jié)腸呈正常淺紅色，糞便呈顆粒狀，PBS+DSS組結(jié)腸呈暗紅色，腸壁腫脹、出血，糞便稀薄，而與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組和CFFE-L+DSS組的結(jié)腸外觀有所改善（圖2C）。為了觀察各組小鼠結(jié)腸組織損傷，我們進(jìn)行了病理分析。結(jié)腸組織HE染色結(jié)果顯示，Control組結(jié)腸無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩解構(gòu)清晰，PBS+DSS組結(jié)腸有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)小面積潰瘍?yōu)樘卣鞯慕M織病理學(xué)變化，與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組結(jié)腸炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度和隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度有所減輕，CFFE-L+DSS組結(jié)腸仍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有潰瘍?yōu)樘卣鞯慕M織病理學(xué)變化（圖2D）。

圖2 CFFE處理對(duì)結(jié)腸炎小鼠的影響

2.3 CFFE處理對(duì)結(jié)腸炎小鼠的促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響 與Control組相比，PBS+DSS組結(jié)腸Il-6和Tnf基因表達(dá)水平顯著升高，與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組結(jié)腸組織Il-6和Tnf基因表達(dá)水平降低，CFFE-L+DSS組結(jié)腸組織Il-6的基因表達(dá)無顯著性差異，但Tnf的基因表達(dá)水平降低（圖3A和3B）。同時(shí)，與Control組相比，PBS+DSS組結(jié)腸MCP-1的基因表達(dá)水平顯著升高，而KC的基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有增加的趨勢(shì)，與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組和CFFE-L+DSS組的MCP-1和KC表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CFFE-H+DSS組結(jié)腸的MCP-1呈一定的下降趨勢(shì)（圖3C和3D）。此外，與PBS+DSS組相比，CFFE-H+DSS組和CFFE-L+DSS組結(jié)腸組織IL-6和TNF-α蛋白分泌水平顯著降低（圖3E和3F）。

圖3 CFFE處理對(duì)結(jié)腸促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

2.4 CFFE處理對(duì)炎癥信號(hào)通路激活的影響 4組小鼠結(jié)腸組織中IκB、磷酸化（p-IκB）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38）、磷酸化p38（p-p38）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（Erk）、磷酸化Erk（p-Erk）7蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PBS+DSS組磷酸化Jnk（p-Jnk）蛋白表達(dá)水平同Control組相比明顯升高，CFFE-H+DSS組結(jié)腸組織p-Jnk蛋白表達(dá)水平明顯弱于PBS+DSS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 CFFE處理可抑制小鼠結(jié)腸Jnk的活化

3 討論

腸道是機(jī)體病原微生物聚集的主要部位，異常的免疫反應(yīng)是IBD反復(fù)發(fā)作的主要原因。維持腸道穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，增強(qiáng)腸道的抗炎能力將有助于IBD易感個(gè)體維持和改善腸道健康狀態(tài)。油茶肉質(zhì)果是一種可食用的優(yōu)質(zhì)水果，且具有抗炎抗氧化作用，但目前關(guān)于油茶肉質(zhì)果對(duì)結(jié)腸炎的影響尚無實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

本研究中，我們探討CFFE是否能有效預(yù)防實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的發(fā)展，其中體重減輕和結(jié)腸縮短是DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的主要特征；促炎癥細(xì)胞因子IL-6是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的刺激免疫反應(yīng)中主要的促炎癥細(xì)胞因子之一［20］；TNF-α是來源于活化的巨噬細(xì)胞的經(jīng)典細(xì)胞因子之一；MCP-1和KC是誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移的趨化因子［21］。我們觀察到，高濃度的CFFP能顯著改善結(jié)腸炎的一些主要特征，包括體重變化、結(jié)腸長(zhǎng)度、促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

MAPK超家族由三條主要信號(hào)通路組成：Erk、Jnk和p38［22］。參與調(diào)控多種細(xì)胞過程，能將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)炎癥、疼痛等多種病理生理過程［22-23］。在MAPK通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，根據(jù)細(xì)胞和刺激不同來激活相應(yīng)的MAPK激酶及下游分子［24］，其中Erk主要由MKK1激活［24］，P38主要由MKK3/6和MKK4激活［25］，Jnk由MKK4和MKK7激活［26］，使這些蛋白分子在不同疾病中發(fā)揮獨(dú)特作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，Jnk抑制劑阻斷Jnk通路后可以緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的腸道炎癥［27］。本研究發(fā)現(xiàn)CFFP能顯著抑制Jnk的活化。提示CFFP可能對(duì)結(jié)腸炎的發(fā)生有一定的抑制作用。

本研究也存在一定的局限性：首先，CFFE是一種復(fù)雜的化合物，雖然我們鑒定了CFFP的一些抗炎生物活性成分，但對(duì)于其他成分可能的作用還不清楚。第二，由于CFFE來源有限，我們只選擇了兩種濃度，對(duì)最佳的濃度還有待進(jìn)一步研究。第三，除了對(duì)體內(nèi)研究外，尚未進(jìn)行體外研究，保護(hù)腸道機(jī)制還不夠深入。

綜上所述，我們目前的研究表明，CFFE可能通過抑制Jnk通路激活和炎癥因子表達(dá)預(yù)防結(jié)腸炎。