聚乳酸-羥基乙酸共聚物負載siRNA-circCALN1治療鼻咽癌的初步研究

江浩，張鑫，舒能何，陳舒華，曲延玉，龔媛

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院/佛山市第二人民醫(yī)院病理科，廣東 佛山 528000；2.贛州市章貢區(qū)水東鎮(zhèn)衛(wèi)生院，江西 贛州 341000；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院/佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科；4.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院/佛山市第二人民醫(yī)院全科，廣東 佛山 528000）

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部黏膜的惡性腫瘤，是我國高發(fā)惡性腫瘤之一［1］。鼻咽癌的5年生存率只有60%左右，造成鼻咽癌治療效果差的原因主要是原病灶局部的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移［2-3］。環(huán)狀核糖核酸（Cyclic ribo?nucleic acid，circRNAs）是一種非編碼RNA分子，具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，無5′端帽和3′端尾［4］。近年來，許多研究表明，circRNAs作為miRNA海綿，調(diào)節(jié)基因表達或參與細胞凋亡、增殖和其他病理過程，在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［5］。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀核糖核酸CALN1（Cyclic ri?bonucleic acid calneuron 1，circRNA CALN1）在鼻咽癌組織中明顯高表達。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：circRNA CALN1與miR-143-3p存在調(diào)控作用，而B淋巴細胞瘤-2基因（B cell lymphoma 2， BCL-2）是miR-143-3p調(diào)控的靶基因之一，circRNA CALN1參與鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展。我們通過實驗也證明了circCALN1/miR-143-3p/BCL-2調(diào)控軸影響了鼻咽癌細胞的增殖與侵襲，這為臨床上鼻咽癌的治療提供了新的干預(yù)靶點［6］。小干擾核酸（Small interfering RNA，siRNA）是長度為21～23個核苷酸的雙鏈RNA分子，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因表達［7］。我們設(shè)計并合成了一種siRNA（本研究中稱為siRNAcirc CALN1），可特異性抑制circ CALN1的表達。

游離的siRNA在血液中不穩(wěn)定，容易被核糖核酸酶降解［8］。目前，納米顆粒作為運載體的研究越來越多，已經(jīng)設(shè)計并研究了幾種多功能遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、膠束和無機納米粒子，用于不同藥物或siRNA的共遞送［9-11］。其中，聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］是美國FDA批準的生物相容性聚合物［12-13］。其降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，安全無毒。納米顆粒能在血液中長時間循環(huán)，隨后在腫瘤組織中被動積累，使納米顆粒能逃離網(wǎng)狀內(nèi)皮區(qū)域，減少其在肝臟部位的處理，且納米顆粒的持續(xù)循環(huán)可增加全身給藥后到達腫瘤組織的可能性。因此，本研究制備了載siRNA的PLGA-siRNA-circ CALN1，并對其抗癌作用進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 聚乙烯亞胺（Polyethylene imine，PEI）和氯化鈉購自阿拉?。唤固妓岫阴ィ―iethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）；TRIzol試劑、RIPA細胞裂解液購自北京塞默飛生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；實時定量PCR儀購自美國ABI公司。其他試劑都為化學(xué)純試劑。

高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM，JEM-2100 F；JEOL，Tokyo，Japan）生成透射電子顯微照片。掃描電子顯微鏡（SEM，Regulus8100；Hitachi Limited，Tokyo，Japan）用于生成SEM圖像。Malvern Zetasizer Nano ZS（英國馬爾文）用于檢測動態(tài)光散射（DLS）和表觀zeta電位。超純水取自Millipore超純水機制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 鼻咽癌細胞（CNE1和HNE1）購于廣州海納生物科技有限公司，細胞培養(yǎng)參照標準操作規(guī)程傳代，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，鼻咽癌細胞用5% FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3天傳代培養(yǎng)。實驗選用對數(shù)生長期、錐蟲藍拒染率＞95%的細胞。

1.2.2 siRNA的設(shè)計 設(shè)計并合成了3個針對circ CALN1后剪接區(qū)的siRNA序列（siRNA1 circ CALN1、siRNA2 circ CALN1和siRNA3 circ CALN1）和非功能性siRNAs（Non-functional siRNA，siRNA NC）。不同siRNA的寡核苷酸序列見表1。

表1 不同siRNA的寡核苷酸序列

1.2.3 RT-PCR 采取TRIzol試劑提取RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系：5.0 μL cDNA，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL 2×SYBR Green qPCR SuperMix，4.0 μL ddH2O，總體積20 μL。反應(yīng)條件：55 ℃ 2 min；93 ℃ 2 min，93℃ 15 s，60 ℃ 32 s讀板，35個循環(huán)；熔解曲線分析：溫度60 ℃，94 ℃，每個樣本重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參，以2–ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.2.4 PLGA-siRNA circ CALN1納米粒（NPs）的制備方法 PLGA納米膠囊采用水-油-水（w/o/w）雙乳液法制備，將PLGA（聚乳酸和聚乙醇酸比例為50∶50）（50 mg）溶解在二氯甲烷（DCM）（500 μL）中，加入siRNA和聚乙烯亞（PEI）胺混合溶液（150 μL），冰上超聲（50 W，30 s），然后將乳劑加入聚乙烯醇PVA溶液（3 mL，4%）中超聲。將此雙乳液與另一種PVA溶液（7.5 mL，0.3%）混合，在室溫下用磁力攪拌器大力混合3 h，使DCM蒸發(fā)。懸浮液離心（18 000 rpm，10 min），用無核酸酶的超純水洗滌2次，真空冷凍干燥8 h。

1.2.5 粒徑和電位測定 將200 μL新鮮制備的PLGA-siRNA circ CALN1 NPs 混懸液用去離子水稀釋至3 mL后置于納米激光粒度分析儀中測定粒徑、多分散系數(shù)（Polydispersity， PDI）和Zeta電位。

1.2.6 包封率（Encapsulation efficiency， EE）的測定

1.2.6.1 標準曲線的制備 選用熒光標記的siRNA，通過測定熒光強度對siRNA進行定量分析。將siRNA用DEPC處理水分別稀釋為1、2、5、10、20、50、100和200 ng·mL-1的標準溶液，取100 μL各質(zhì)量濃度標準溶液置于酶標板中，在激發(fā)波長為492 nm，發(fā)射波長為518 nm處測定熒光強度（Fluorescence intensity， FI）。將測得的FI值對FAM-siRNA濃度（Concentration， C）進行線性回歸獲得標準曲線方程。

1.2.6.2 EE的測定 取200 μL PLGA-siRNA circ CALN1 NPs混懸液于0.5 mL離心管中，置于超高速冷凍離心機中，在4 ℃條件下，13 000 rpm離心30 min。測定上清液的熒光強度，代入標準曲線方程中求得上清液中未被包載的siRNA的質(zhì)量濃度（Cunloaded），代入公式計算EE。

其中，WsiRNA表示加入的總的siRNA的質(zhì)量（ng），Cunloaded表示未包載的siRNA的質(zhì)量濃度（ng·mL-1），V表示離心上清液的體積（mL）。

1.2.7 CCK-8法檢測細胞增殖 取兩種對數(shù)生長期鼻咽癌細胞（CNE1和HNE1），用分別含有PBS、PLGA-siRNA NC、PLGA-siRNA circ CALN1 NPs 20 μL的無血清RPMI-1640新鮮培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為105個·mL-1，接種96孔板，每孔100 μL，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL繼續(xù)孵育4 h。選擇450 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）分析組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同PLGA-siRNA處理CNE1和HNE1中circ CALN1的表達 通過對兩種不同鼻咽癌細胞（CNE1和HNE1）提取RNA，進行RT-PCR結(jié)果表明，PLGA-siRNA2 circ CALN1和PLGA-siRNA3 circ CALN1均顯著抑制CNE1和HNE1中circ CALN1的相對表達（圖1、圖2）。PLGA-siRNA3 circ CALN1對circ CALN1相對表達的抑制作用最強。然而，PLGA-siRNA NC和PLGA-siRNA1 circ CALN1均未表現(xiàn)出這種抑制作用。因此，PLGA-siRNA3 circ CALN1被選為最佳的circ CALN1抑制劑，并在后續(xù)實驗中重命名為PLGA-siRNA circ CALN1。

圖1 RT-PCR分析測定不同PLGA-siRNA處理的CNE1中circ CALN1的相對表達

圖2 RT-PCR分析測定不同PLGA-siRNA處理的HNE1中circ CALN1的相對表達

2.2 PLGA-siRNA circ CALN1納米粒的表征

2.2.1 使用掃描電鏡和透射電鏡對PLGA-siRNA circ CALN1納米粒子進行表征，從掃描電鏡和透射電鏡圖中可以看出，各納米粒子均呈球形，納米粒子在圖像中分布較為均勻（圖3、圖4）。

圖3 PLGA-siRNA circ CALN1納米粒子SEM圖像

圖4 PLGA-siRNA circ CALN1 納米粒子TEM圖像

2.2.2 粒徑（DLS）與Zeta電位 PLGA經(jīng)負載siRNA-circ CALN1，平均粒徑由183 nm增大到205 nm，PDI=0.45。Zeta電位由初始的-11 mV，經(jīng)負載后電位也有所增加（-14 mV），說明siRNA已經(jīng)成功負載。

2.3 FAM-siRNA的標準曲線 測定各濃度FAM-siRNA溶液的熒光強度，將熒光強度值對質(zhì)量濃度進行線性回歸，得方程FI=0.006C-0.001 7，R2=0.999 4。在質(zhì)量濃度范圍為1～200 ng·mL-1，F(xiàn)AMsiRNA的熒光強度與質(zhì)量濃度線性相關(guān)性良好，可用于FAM-siRNA的定量分析。

2.4 EE的計算 通過繪制好的標準曲線，將所測得的納米粒子熒光強度帶入實驗方法中的EE%公式計算得：EE%為（92.3±5.4）%。

2.5 PLGA-siRNA circ CALN1對鼻咽癌細胞增殖的影響 本研究中，在培養(yǎng)24、48、72、96 h后，PLGA-siRNA circ CALN1組相較于PLGA-siRNA NC組和對照組可顯著抑制鼻咽癌細胞（CNE1和HNE1）的增殖（圖5、圖6）；PLGA-siRNA NC組與對照組相比無明顯差異。

圖5 PLGA-siRNA circ CALN1對CNE1中細胞增殖影響

圖6 PLGA-siRNA circ CALN1對HNE1中細胞增殖影響

3 討論

鼻咽癌是一種上皮性惡性腫瘤，起源于咽部黏膜間隙的上部。鼻咽癌主要在亞洲流行，2015年中國報告了6萬例新增鼻咽癌病例，與多種因素有關(guān)，包括病毒、環(huán)境和遺傳因素［14］。目前，鼻咽癌仍然是最難發(fā)現(xiàn)和治療的癌癥類型之一。NPC的潛在途徑和潛在機制還不清楚。越來越多的證據(jù)表明，異常表達的非編碼RNA（ncRNAs）［包括microRNAs（miRNAs）、長ncRNAs和一些環(huán)狀RNAs（cir?cRNAs）］是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的原因，包括鼻咽癌。對circRNAs的表達調(diào)控可使其作為腫瘤抑制因子或癌基因，控制細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移［15］。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)circ CALN1在鼻咽癌中高度表達，是鼻咽癌治療的新靶點［6］。這一發(fā)現(xiàn)擴大了circ CALN1的潛在臨床應(yīng)用。眾所周知，游離的siRNA在血液中不穩(wěn)定，容易被核糖核酸酶降解。聚乳酸-羥基乙酸共聚物是美國FDA批準的生物相容性聚合物，已被廣泛用于生物載體的開發(fā)，其降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，是安全無毒的理想運載體?；诖?，我們制備了一種新的穩(wěn)定、安全、有效的鼻咽癌抗癌藥物—PLGA-siRNA circ CALN1，它可以特異性地靶向circ CALN1，并用于鼻咽癌臨床治療的新藥物。

本研究表明，PLGA-siRNA circ CALN1對鼻咽癌細胞增殖具有顯著的抑制作用，PLGA載體有很強的安全性，表明PLGA-siRNA-circ CALN1是一種很有前景的抗癌藥物，可抑制鼻咽癌細胞中circ CALN1的表達。但由于研究未在動物實體瘤中證明這一現(xiàn)象，存在一定的不足之處。今后，我們將構(gòu)建動物模型進一步論證。