利用SSR 標(biāo)記鑒定新疆地方葡萄品種資源親緣關(guān)系

王 勇 孫 鋒 李玉玲 蘇來曼·艾則孜 伍國紅 郭平峰

新疆是我國重要的葡萄種植區(qū)， 葡萄面積和產(chǎn)量均居全國首位， 同時擁有豐富的葡萄種質(zhì)資源。 在葡萄生產(chǎn)中，主要通過枝蔓扦插、綠枝嫁接等無性繁殖方式繁育苗木， 一些小型育苗企業(yè)或果農(nóng)根據(jù)自己的意愿隨意命名， 導(dǎo)致“多品同名”或“同物異名”現(xiàn)象嚴(yán)重，給苗木市場經(jīng)營和果農(nóng)生產(chǎn)造成了很大影響， 甚至產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟損失。 新疆葡萄瓜果研究所幾十年來不斷在全疆開展葡萄種質(zhì)資源普查、 收集與保存工作， 目前已收集疆內(nèi)大多數(shù)地方品種資源，現(xiàn)選擇6 組地方品種資源利用SSR 標(biāo)記對其親緣關(guān)系進行鑒定， 為品種資源利用和新疆葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料 試驗材料均來自新疆葡萄瓜果研究所葡萄種質(zhì)資源圃， 為4 年生6 個新疆地方品種近似或疑似組合19 個品種， 詳見表1。

表1 參試新疆地方品種資源

1.2 引物 引物為課題組前期以107 份葡萄種質(zhì)資源為材料篩選出的15 對SSR 標(biāo)記，詳見表2。

表2 15 對葡萄基因組SSR 標(biāo)記引物

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄基因組DNA 的提取 參照CTAB改良法提取葡萄試材基因組DNA； 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的試材基因組DNA 的濃度和純度； 將DNA 溶液分為兩份， 1 份放入-20 ℃冰箱中長期保存， 1 份放入4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 反應(yīng)體系 使用PCR 反應(yīng)體系為2×Taq Mix 酶10 μL，SSR 雙引物混合液（10 μmol/mL）0.8 μL，模板（20 ng/μL）2 μL，dd H2O 7.2 μL；總反應(yīng)體系為20 μL，PTC-100 型PCR 儀上進行反應(yīng)。擴增程序參照王勇等的方法，在操作中根據(jù)各引物差異進行體系優(yōu)化。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物的檢測 利用2%瓊脂糖凝膠對擴增的PCR 產(chǎn)物進行水平電泳檢測，若有擴增結(jié)果不理想的， 需要進行補充， 然后由生物技術(shù)公司通過毛細(xì)管電泳檢測產(chǎn)物片段種類和大小。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 軟件處理數(shù)據(jù)，利用NTSYSpc 2.10 s 軟件繪制遺傳距離矩陣和親緣關(guān)系樹狀圖，進行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試品種組合的親緣關(guān)系 如表3 所示，15 對SSR 標(biāo)記在6 組新疆地方品種組中擴增的位點基因和等位基因的數(shù)量存在很大差異。擴增基因數(shù)在26～58 之間， 其中馬奶子近似品種最多（58 個）， 無核白近似品種最少（26個）。

表3 15 對SSR 標(biāo)記對6 組新疆地方品種擴增的位點基因和等位基因

6 組新疆地方品種組中， 每一組所有品種具有的相同基因比率在6.9%～100%之間。 其中，無核白近似品種和木納格近似品種的最高，均為100%；馬奶子近似品種的最低，為6.9%；其次為和田地方品種的，為8%。

擴增等位基因數(shù)在15～51 之間， 其中馬奶子近似品種最多（51 個）， 無核白近似品種最少（15 個）。 6 組新疆地方品種組中的每一組合所有品種具有的相同基因比率在0%～100%之間。 其中， 無核白近似品種和木納格近似品種的最高， 均為100%； 馬奶子近似品種的最低，為0。 這說明6 個組每個組品種間的親緣關(guān)系存在很大差異， 大小順序為馬奶子近似品種＞和田地方品種＞喀什喀爾疑似品種＞無核白雞心疑似品種＞木納格近似品種=無核白近似品種。

2.2 參試品種組合親緣關(guān)系分析

2.2.1 無核白5 個近似品種親緣關(guān)系分析 無核白、長穗無核白、長粒無核白、大粒無核白、香蕉王的遺傳距離和相似系數(shù)如圖1 所示。 5 個品種的遺傳距離為0，相似系數(shù)為1，說明長穗無核白、長粒無核白、大粒無核白、香蕉王應(yīng)為無核白營養(yǎng)系， 在15 個SSR 標(biāo)記基因位點上不存在差異。

圖1 無核白與4 個近似品種的遺傳距離和相似系數(shù)

2.2.2 參試馬奶子5 個近似品種親緣關(guān)系分析馬奶子、夏馬奶、紅馬奶、紫馬奶、里扎馬特的遺傳距離和相似系數(shù)如圖2 所示。 就遺傳距離而言，最近的是馬奶子與夏馬奶，為0.018 2，其次為紅馬奶與紫馬奶，為0.668 9；最遠(yuǎn)的是里扎馬特與紫馬奶，為1.250 9，其次為紅馬奶與夏馬奶，為1.029 6；其他品種間的值居于中間。 就相似系數(shù)而言， 相似度最高的是馬奶子與夏馬奶，為0.98，其次為馬奶子與里扎馬特，為0.538，相似度最低處為0.46，在此處將5 個品種分為兩類：一類為馬奶子、夏馬奶、里扎馬特，另一類為紅馬奶、紫馬奶。 在相似系數(shù)0.538 處將里扎馬特與馬奶子、夏馬奶分開；在相似系數(shù)0.564 處將紅奶子與紫馬奶分開。這說明，5 個品種中，馬奶子與夏馬奶存在較近的親緣關(guān)系，與其他品種及其他品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)， 為不同類型品種，可能因果實性狀類似馬奶而命名。

圖2 馬奶子與4 個近似品種的遺傳距離和相似系數(shù)

2.2.3 參試和田地方品種親緣關(guān)系分析 圖3表明， 和田地區(qū)的3 個地方品種的遺傳距離較遠(yuǎn)，相似系數(shù)較小。 其中和田紅與和田綠、和田黃的遺傳距離分別為0.916 3、1.252 6， 和田黃與和田綠的遺傳距離為0.800 6。和田紅與和田綠、和田黃的相似系數(shù)約為0.35，和田綠與和田黃的相似系數(shù)為0.46。 這說明3 個品種可能為不同類型品種。

圖3 3 個和田地方品種的遺傳距離和相似系數(shù)

2.2.4 參試木納格近似品種親緣關(guān)系分析 圖4 表明， 綠木納格與紅木納格的遺傳距離為0，親緣關(guān)系相似系數(shù)為1。 這說明兩者可能為同一品種或其中一個為另一個的芽變類型。

圖4 2 個木納格近似品種的遺傳距離和相似系數(shù)

2.2.5 參試無核白雞心疑似品種親緣關(guān)系分析圖5 表明， 無核白雞心與香妃無核白雞心的遺傳距離為0.557 7，親緣關(guān)系相似系數(shù)為0.4。這說明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不是同一品種。

圖5 無核白雞心與香妃無核白雞心遺傳距離和相似系數(shù)

2.2.6 參試喀什喀爾與花葉哈什哈爾親緣關(guān)系分析 圖6 表明，喀什喀爾與花葉哈什哈爾的遺傳距離為0.821 0， 親緣關(guān)系相似系數(shù)為0.28。這說明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為不同品種。

圖6 喀什喀爾與花葉哈什哈爾的遺傳距離和相似系數(shù)

3 結(jié)論

利用15 對葡萄基因組SSR 標(biāo)記引物對6組19 個新疆葡萄地方品種植株DNA 基因位點的基因型進行了測定與分析。 結(jié)果表明，6 個組合每個組合品種間的親緣關(guān)系差異較大。其中，無核白近似組合和木納格近似組合的親緣關(guān)系最近，馬奶子近似組合的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，喀什喀爾近似組合次之。

在無核白近似組合中，5 個品種的親緣關(guān)系相同， 可能為同一品種或無核白及無核白芽變。在馬奶子近似組合中， 馬奶子與夏馬奶關(guān)系近似，其他品種間關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為是不同品種類型，可能因果實性狀類似馬奶而命名。 和田紅、和田綠、和田黃3 個品種為不同品種。 綠木納格和紅木納格可能為同一品種或其中一個為另一個的芽變類型。 無核白雞心與香妃無核白雞心為不同品種。 喀什喀爾與花葉哈什哈爾為不同類型。

本研究僅利用15 對SSR 標(biāo)記對試驗材料對應(yīng)位點的基因型進行了分析， 可能存在局限性， 下一步需要通過植物學(xué)和果實性狀進一步驗證。