不同果肉厚度的苦瓜種質細胞大小和形態(tài)差異分析

裘波音 李大忠 林琿 張前榮 溫慶放 朱海生

摘 要：為探討苦瓜果肉生長規(guī)律及細胞大小和形態(tài)對果肉發(fā)育的影響，以2份不同果肉厚度苦瓜種質（分別為LX13、ZK54）為材料，分析不同時期果肉厚度動態(tài)變化以及細胞大小和形態(tài)參數(shù)，研究不同指標之間的相關性。結果表明：（1）2份苦瓜種質果肉厚度隨果實發(fā)育不斷增大，在花后17、23 d種質間差異顯著。（2）LX13細胞面積在花后10、17和23 d差異顯著，細胞周長、長度、寬度在4個取樣時間差異顯著，ZK54細胞面積花后17 d顯著大于花后10 d，細胞周長、長度在花后3、10和17 d差異顯著，細胞寬度在4個時間差異顯著；在花后17、23 d，LX13細胞面積、細胞周長、長度和寬度均顯著大于ZK54。（3）LX13細胞縱橫比和圓度在花后17、23 d顯著大于花后3、10 d，ZK54兩個指標在花后17 d顯著大于花后3、10 d，但花后23 d這兩個指標均顯著小于花后17 d；在花后17、23 d，

LX13的細胞縱橫比和圓度顯著大于ZK54。（4）相關分析顯示細胞參數(shù)與果肉厚度之間均呈顯著或極顯著正相關，表明細胞發(fā)育對苦瓜果實的生長起關鍵作用。

關鍵詞：苦瓜；果肉厚度；細胞大?。患毎螒B(tài)

中圖分類號：S 642.5? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）03-0014-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.003

Abstract： In order to investigate the rule of pulpy growth and the influence of cell size and morphology on pulpy development， two kinds of bitter gourd with different pulp thickness（LX13 and ZK54） were used to analyze the dynamic changes of pulpy thickness and the parameters of cell size and morphology in different periods， and to study the correlation between different indexes. The results show that： （1） Pulp thickness increased as the fruit develops， andsignificantly different between two germplasms at 17 and 23 days after flowering. （2） Cell area of LX13 was significantly different at 10，17and 23 days after flowering， andcell perimeter， length and width were significantly different at all 4 sampling times. Cell area ofZK54was significantly larger at 17 days after flowering than at 10 days after flowering， cell perimeter and length were significantly different at 3， 10 and 17 days after flowering， cell width was significantly different at all 4 sampling times. Cell area， perimeter， length and width of LX13 at 17 and 23 days after floweringwere significantly greater than ZK54. （3） Cell aspect ratio and roundness of LX13 at 17 and 23 days after flowering were significantly greater than at 3 and 10 days after flowering. Cell aspect ratio and roundness of ZK54 were significantly higher at 17days after flowering than at 3 and 10 days after flowering， but these indicators at 23 days after flowering were rather smaller than at 17 days after flowering. Cell aspect ratio and roundness of LX13 were significantly higher than ZK54 at 17 and 23 days after flowering. （4） Correlation analysis showed that cell size and morphological parameters were significantly or extremely significantly positively correlated with flesh thickness， indicating that cell development played a key role in the growth of bitter melon fruit.

Key words： Bitter gourd （Momordica charantia）； Fruit flesh thickness； Cell size； Cell morphology

果肉是薄壁組織，主要由薄壁細胞、胞間層和細胞間隙組成[1]，果肉細胞的大小和形態(tài)與果實生長發(fā)育之間存在重要的關聯(lián)，如獼猴桃果肉細胞在果實成熟期間體積明顯變大，細胞形狀由圓形變?yōu)殚L條形[2]；葡萄果肉細胞在果實生長初期呈放射線狀迅速分裂，細胞數(shù)量急劇上升，隨著果實生長，細胞體積也向放射線方向擴大，逐漸變成球狀[3]；蘋果果肉細胞在果實軟化后分離嚴重，排列松散[4]；大久保桃果肉細胞在果實成熟初期結構完整，但隨著成熟度增加，胞間層逐漸出現(xiàn)裂痕，進入衰老階段，原生質整體發(fā)生崩潰，細胞壁也變得非常松馳[5]；不同成熟度油桃果肉細胞在盛花期后104、108、112 d排列整齊緊密，但在貯藏50 d后，細胞之間開始分離，且細胞間隙不斷增大[6]。研究顯示，細胞大小和形態(tài)對果實產(chǎn)量和品質也有很大的影響，如馬鈴薯塊莖細胞越大，塊莖硬度越小[7]；甜瓜果肉細胞越小，質地越硬[8]；蘋果果肉細胞越圓，果實硬度越大，且果肉細胞結構差異在成熟期達到最大[9-10]；與3個近等基因系相比，黃瓜Q30品系細胞最小，密度最大，但果實卻最長[11]，表明細胞的大小、形態(tài)、結構等因素對果實的生長發(fā)育以及產(chǎn)量和品質的形成意義重大。

苦瓜Momordica charantia L.，葫蘆科苦瓜屬一年生植物，性濕耐熱，多為春、秋兩季種植，原產(chǎn)印度尼西亞，在中國、日本等亞洲國家以及加勒比海群島等地均有廣泛的栽培[12-13]?？喙瞎麑崰I養(yǎng)豐富，包含各種氨基酸、糖類、維生素和鈣、鐵等礦物質，具有降低血糖、促進食欲、排毒養(yǎng)顏等功效[14]。其中，果肉作為主要的食用和藥用部分，其品質好壞最終決定苦瓜的利用價值和經(jīng)濟效益[15]。迄今為止，關于苦瓜果肉細胞相關研究尚未見報道，因此，本試驗以不同果肉厚度的苦瓜為材料，分析不同發(fā)育階段果肉細胞大小和形態(tài)的變化規(guī)律，同時挖掘與果肉厚度之間的關系，以期為苦瓜生長發(fā)育調控機理的探討提供佐證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基于前期對70份苦瓜種質果肉厚度的觀測，結合一般線性模型的單因素分析進行多重比較，方法選用Tamhane′s T2（P≤0.01），發(fā)現(xiàn)LX13和ZK54果肉厚度具有極顯著差異[16]，因此以兩者為材料進行相關試驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 FAA固定液、植物軟化液、環(huán)保型脫蠟透明液、番紅固綠（植物）染液均購于武漢賽維爾生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.2 主要儀器 脫水機（Donatello，意大利DIAPATH）、包埋機（JBP5，武漢俊杰）、病理切片機（RM2016，上海徠卡）、凍臺（JBL5，武漢俊杰）、組織攤片機（KDP，金華科迪）、烤箱（GFL230，天津萊玻瑞）、正置光學顯微鏡（NIKON ECLIPSE E100，日本尼康）、成像系統(tǒng)（NIKON DSU3，日本尼康）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗過程 試驗材料于2月下旬在培養(yǎng)箱恒溫催芽，3月上旬進行基質育苗，下旬定植于福州基地大棚。于開花當日授粉，花后3、10、17和23 d進行觀測并取樣。

1.3.2 果肉厚度測定 每份種質取長勢均勻的健康苦瓜各5個，利用游標卡尺測量果實橫徑和果實腔徑，通過以下公式計算果肉厚度：果肉厚度=（果實橫徑-果實腔徑）×0.5。

1.3.2 組織軟化石蠟包埋 （1）固定：取兩品種果肉，長、寬、高各0.5 cm；放入FAA固定液中固定至少24 h；（2）修材：將組織修薄為 2～3 mm，然后將打印好的標簽與組織一一對應放在脫水盒中；（3）軟化：將脫水盒入植物軟化液中，密封，放入55℃鼓風干燥箱中進行軟化，軟化液更換周期為 7 d，每周觀察1次軟化程度；（4）脫水浸蠟：將軟化好的植物流水沖洗 30 min，放入15%的乙醇浸泡2 h后進行30%酒精 1 h、50%酒精1 h、75%酒精2 h、85%酒精1.5 h、90%酒精1.5 h、95%酒精1.5 h、100%酒精1 h、100%酒精1 h分級脫水，隨后進行二甲苯8 min、二甲苯20 min、二甲苯20 min、 石蠟30 min、石蠟1 h、石蠟2 h依次浸蠟處理；（5）包埋：先將融化的蠟放入包埋框，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽。于-20℃凍臺冷卻，蠟凝固后取出并修整蠟塊；（6）切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片，厚度為5 μm，切片漂浮于攤片機 40℃ 溫水上將組織展平，載玻片撈起，60℃烘箱內烤片，水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 番紅固綠染色 （1）切片脫蠟：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟透明液20 min、無水乙醇5 min、75%酒精5 min進行處理，用自來水進行清洗；（2）番紅染色：切片入植物番紅染色液中染色2h，自來水稍洗，洗去多余染料；（3）脫色：切片依次入50%、70%、80%梯度酒精中各3～8 s；（4）固綠染色：切片入植物固綠染色液中染色6～20 s，無水乙醇三缸脫水；（5）透明封片：切片入干凈的二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

1.3.4 鏡檢和圖像采集 使用正置光學顯微鏡進行細胞形態(tài)觀察，利用成像系統(tǒng)進行不同放大倍率（20倍、40倍和200倍）的圖像采集。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 用 Imagepro plus 6.0 軟件對果肉組織切片進行圖像分析，獲得4個細胞大小參數(shù)和2 個細胞形狀參數(shù)，細胞大小參數(shù)包括面積、周長、長度（用最大費雷特直徑表示）和寬度（用最小費雷特直徑表示），數(shù)據(jù)以均值±標準誤差表示，采用 Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，通過SPSS 21.0軟件進行相關性分析和多重比較（Duncan法），以P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 2份苦瓜種質不同發(fā)育時期果肉厚度差異

由圖1可知，隨著果實的發(fā)育，2份苦瓜種質的果肉厚度均增大，但在前3 d增長較慢，隨后增長迅速，17 d后又逐漸緩慢，整體呈“慢-快-慢”的趨勢。LX1-3果肉厚度在花后3、10和17 d差異顯著，花后17、23 d差異不顯著；ZK54果肉厚度在4個時間差異均達顯著水平。2份種質同一時期果肉厚度也不同，其中花后3 d和10 d，LX1-3的厚度略小于ZK54，但差異不顯著；花后17、23 d差異均達顯著水平。

2.2 2份苦瓜種質不同發(fā)育時期細胞大小差異

由表1可知，同一種質不同發(fā)育時期細胞大小參數(shù)表現(xiàn)不一。LX13的細胞面積在花后3、10 d兩者差異不顯著，在花后10、17 d和23 d差異顯著；ZK54的細胞面積在花后3、10 d差異不顯著，花后17 d則顯著大于花后10 d，花后23、17 d兩者差異不顯著。LX13的細胞周長、長度、寬度在4個時間均差異顯著；ZK54的細胞周長、長度在花后3、10和17 d差異顯著，在花后17、23 差異不顯著，細胞寬度在4個時間差異顯著。同一取樣時間2份種質間表現(xiàn)也不同，在花后3、10 d，LX13和ZK54的細胞面積、細胞周長、長度和寬度均無顯著差異；在花后17、23 d，LX13的這4個指標均顯著大于ZK54。

2.3 2份苦瓜種質不同發(fā)育時期細胞形態(tài)差異

由表2可知，LX13和ZK54的細胞縱橫比和圓度整體呈“先升后降”的趨勢，其中LX13的兩個指標在花后3、10 d無顯著差異，花后17、23 d則顯著大于花后3、10 d，花后17、23 d差異不顯著；ZK54的兩個指標在花后3、10 d無顯著差異，花后17 d則顯著大于花后3、10 d，但花后23 d這兩個指標均顯著小于花后17 d。同一發(fā)育時期2份種質間表現(xiàn)也不同，在花后3、10 d，2份種質間的細胞縱橫比和圓度無顯著差異，但花后17、23 d，2份種質間差異顯著。

由圖2可知，從細胞整體形態(tài)來看，在花后3、10 d，2份種質的細胞排列均較為緊密，細胞較為完整，在花后17、23 d，細胞排列逐漸松散，且花后23 d，細胞出現(xiàn)部分破損現(xiàn)象。

2.4 2份苦瓜種質細胞參數(shù)與果肉厚度相關分析

由表3可知，2份苦瓜種質細胞參數(shù)與果肉厚度之間均為正相關關系，其中4個細胞大小參數(shù)均為極顯著正相關，2個細胞形態(tài)參數(shù)之間也為極顯著正相關。細胞面積、寬度和縱橫比、圓度兩兩之間呈顯著正相關，細胞周長、長度和縱橫比、圓度兩兩之間呈極顯著正相關，將細胞大小及形態(tài)參數(shù)和果肉厚度之間兩兩相關，發(fā)現(xiàn)細胞周長、長度、寬度、縱橫比和圓度與果肉厚度之間均極顯著正相關，而細胞面積與果肉厚度則為顯著正相關，表明細胞的膨大發(fā)育對果肉的發(fā)育影響甚大。

3 討論與結論

果肉厚度、果實橫徑、果實縱徑等是決定果實大小和形態(tài)發(fā)育的重要指標，也是影響品質和產(chǎn)量的關鍵因素[11，15]。前人研究表明，不同物種果實的生長有單“S”型和雙“S”型兩種曲線，其中單“S”型如辣椒、番茄、宣木瓜、火龍果、山核桃等的果實大小與重量隨生長發(fā)育呈“慢-快-慢”的趨勢[17-21]，而雙“S”型如梨、楊梅、歐洲李、杏、番石榴等則呈“慢-快-慢-快-慢”的趨勢[22-26]。同一物種生長發(fā)育曲線也有不同，如溫克葡萄果實縱徑增長呈單S型動態(tài)曲線變化，而橫徑增長卻表現(xiàn)為雙S型變化[27]；藍莓品種奧尼爾、藍雨和布里吉塔的果實橫徑、縱徑、單果重均為雙“S”型生長曲線[28]；品種杰兔、燦爛、粉藍和園藍單果重雙“S”曲線趨勢表現(xiàn)明顯，但橫縱徑曲線雙“S”趨勢卻不明顯[29]；品種魯貝爾的果實單果重變化呈雙“S”型生長曲線，但橫向直徑變化卻呈單“S”型生長曲線[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，LX13和ZK54的果肉厚度變化呈“慢-快-慢”的趨勢，表明其橫向直徑變化為單“S”型生長曲線，這與早期張玉燦等[31]發(fā)現(xiàn)的9個苦瓜雜交組合的果重、果長和果徑的膨大規(guī)律較為一致，表明苦瓜不同種質間可能存在相似的果實發(fā)育模式。

果實的生長發(fā)育是復雜的生理生化變化過程，各組織細胞的大小和形態(tài)也會發(fā)生不同程度的變化[3，5]。早期報道指出，棗耐裂品種一般果肉細胞較小，排列都較為緊密，而不耐裂品種果肉細排列相對疏松[32]；隨著果實發(fā)育，栽培西瓜和飼用西瓜細胞體積先變小后增大，藥用西瓜果肉細胞逐漸變大，細胞壁逐漸出現(xiàn)褶皺，而野生西瓜果肉細胞密度較大，在發(fā)育過程中始終保持緊密排列[33]；富士蘋果在盛花85 d之后出現(xiàn)兩次細胞增大，但秦冠蘋果細胞卻未出現(xiàn)類似變化[34]；雙冬蜜桃在成熟前14 d細胞顯著增大，近核端細胞開始變成長條形，其對照冬雪蜜桃近核端細胞形態(tài)則無明顯變化，在成熟前7 d到成熟期這一階段，雙冬蜜桃近核端部分細胞開始皺縮，細胞排列疏松，胞間出現(xiàn)空腔，細胞邊界逐漸模糊[35]。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，2份苦瓜種質的細胞大小和形態(tài)參數(shù)與果肉厚度呈顯著或極顯著正相關，且隨著果實的生長發(fā)生不同的變化，在花后3 d和10 d，細胞面積、周長、長度、寬度、縱橫比和圓度均有所增加，兩者的細胞排列仍較為緊密，細胞形態(tài)近圓形或橢圓形；在花后17 d，細胞大小和形態(tài)參數(shù)較前兩個時期明顯增加，且2份種質間差異也非常顯著，表明細胞形狀逐漸瘦長，花后23 d LX13的細胞大小參數(shù)仍增長但ZK54沒有出現(xiàn)顯著變化，兩者的細胞縱橫比和圓度略小于花后17 d，說明細胞開始皺縮，結構出現(xiàn)局部破損，果實逐漸進入衰老期，暗示細胞大小和形態(tài)與果肉發(fā)育關系密切，細胞結構變化是果實發(fā)育成熟的重要反應，但不同苦瓜種質在果實成熟過程中經(jīng)歷的生理變化狀態(tài)可能存在差異，仍需進一步深入分析討論。

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（責任編輯：柯文輝）