色桿菌滅活疫苗的制備與免疫效果評(píng)價(jià)

林琳 劉蓓 徐素慧 周倫江 王隆柏 羅偉銘 何曉聰 陳云欽 黃杭 修云芳

摘 要：為防控小熊貓色桿菌病，按細(xì)菌滅活疫苗制備程序?qū)⒑{（福州）大熊貓研究交流中心2008年、2020年分離的2株色桿菌CV08毒株和CV20毒株經(jīng)條件優(yōu)化后滅活，分別制備成滅活菌液與鋁膠佐劑聯(lián)用制備成滅活疫苗。以BALB/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，建立色桿菌感染模型，用2種方式接種CV20毒株滅活疫苗，比較2種接種途徑效果。進(jìn)一步設(shè)計(jì)2株色桿菌半數(shù)致死量（LD50）梯度對(duì)二免后小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果表明：CV20毒株滅活疫苗肌肉注射效果優(yōu)于皮下注射。CV08毒株和CV20毒株對(duì)每只小鼠的LD50分別為3.2×108、5×107CFU。色桿菌CV08毒株滅活疫苗對(duì)不同LD50攻毒小鼠的保護(hù)率為83%、 70% 、60% ；色桿菌CV20毒株滅活疫苗對(duì)不同LD50攻毒小鼠的保護(hù)率為75% 、70% 、10%。試驗(yàn)制備的CV08、CV20毒株疫苗含菌量均為4×109 CFU·mL-1，安全檢驗(yàn)合格，能對(duì)自身菌株感染產(chǎn)生較好的保護(hù)效果但無(wú)交叉保護(hù)效果。

關(guān)鍵詞：小熊貓；色桿菌；滅活疫苗；免疫保護(hù)

中圖分類(lèi)號(hào)：S 859.93? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2023）03-0051-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.009

Abstract： In order to prevent and control the Chromobacterium infection in red pandas， according to the preparation procedure of bacterial inactivated vaccine， two strains of Chromobacterium CV08 strain and CV20 virulent strain isolated from Straits （Fuzhou） Giant Panda Research and Exchange Center in 2008 and 2020 were inactivated after the optimization of conditions， and then the inactivated bacteria solution was prepared by combining with the aluminumcontaining adjuvants to produce the inactivated vaccine. The BALB/c mice were used as the experimental animals to establish a model of Chromobacterium infection. The inactivated vaccine of CV20 virulent strain was inoculated in two ways to compare the effects of the two inoculation routes. The median lethal dose （LD50） gradient of two strains of Chromobacterium was further designed to carry out the challenge protection test on mice after the secondary immunization， and the crosschallenge protection test was also carried out. The results showed that the effect of intramuscular injection with the inactivated vaccine of CV20 virulent strain was better than that of subcutaneous injection. The LD50 of CV08 virulent strain and CV20 virulent strain to each mouse was 3.2×108 and 5×107 CFU，?respectively. The protective rates of the inactivated vaccine of Chromobacterium CV08 virulent strain on the mice challenged with different LD50 were 83%， 70% and 60%， respectively， while the protective rates of the inactivated vaccine of Chromobacterium CV20 virulent strain on the mice challenged with different LD50 were 75%， 70% and 10%， respectively. The bacterial contents of CV08 and CV20 virulent strain vaccines prepared in the experiment were both 4×109 CFU·mL-1， which passed the safety test and could produce better protective effect against the infection of their own strains but had no crossprotective effect.

Key words： Red panda； Chromobacterium； Inactivated vaccine； Immune protection

色桿菌屬是一類(lèi)革蘭氏陰性，嚴(yán)格好氧或兼性厭氧菌，色桿菌屬命名非常混亂，文獻(xiàn)歸納色桿菌屬共有14個(gè)成員[1]，已確定的2個(gè)種為紫色色桿菌與藍(lán)黑色桿菌[2]。其中紫色色桿菌在小熊貓種群中流行主要以發(fā)熱、食欲不振、呼吸困難為主要臨床癥狀，致病性強(qiáng)、發(fā)病迅速、病死率高[3]。紫色色桿菌鮮有感染人，但感染后病程發(fā)展極為迅速，死亡率高，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但大多數(shù)病人有被土壤或積水污染創(chuàng)傷或傷口的病歷[4]。2008年7月，海峽（福州）大熊貓研究交流中心發(fā)現(xiàn)3只小熊貓感染色桿菌，病死率為100%。2020年，該中心6只小熊貓陸續(xù)感染色桿菌，病程發(fā)展很快，發(fā)現(xiàn)癥狀2～5 d死亡。2021年南京紫清湖野生動(dòng)物世界發(fā)生6例色桿菌感染小熊貓病例，其中死亡5例，病死率達(dá)到83.3%[5]，廣州也有發(fā)現(xiàn)小熊貓感染色桿菌病例（內(nèi)部交流資料）。關(guān)于色桿菌感染小熊貓的研究多為臨床調(diào)查、疾病診斷、治療等[3，5-8]?？紤]到該病對(duì)于小熊貓的傳染性和高病死率，若防治工作未做到位，該病可能會(huì)對(duì)圈養(yǎng)小熊貓種群造成毀滅性打擊。保護(hù)易感動(dòng)物是動(dòng)物傳染病防治要素之一，而接種有效疫苗是保護(hù)易感動(dòng)物的重要手段。目前我國(guó)尚無(wú)針對(duì)小熊貓色桿菌的疫苗研究，本研究為小熊貓色桿菌的免疫接種研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及小鼠

色桿菌為海峽（福州）大熊貓研究交流中心2008年、2020年從死亡小熊貓?bào)w內(nèi)分離，純化后用甘油保存法凍存于-70℃冰箱。

試驗(yàn)小鼠為6周雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠（吳氏試驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體重均為20 g左右。

1.2 主要試劑

2%鋁膠佐劑（法國(guó)InvivoGen公司）、40%甲醛溶液（西隴科學(xué)股份有限公司）、無(wú)菌PBS（BL550A，北京蘭杰柯科技有限公司）、血瓊脂平板（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 小鼠致病性試驗(yàn) 將保存的CV08、CV20菌種分別用血瓊脂平板復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)24 h，之后刮平板菌落制菌液，4000 r·min-1，離心10 min，棄上清，用無(wú)菌PBS洗滌3次后加無(wú)菌PBS重懸。倍比稀釋法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定攻毒劑量。取50只小鼠每組5只，2株菌液攻毒濃度均分為1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU·mL-1 5個(gè)梯度。腹腔注射攻毒每只小鼠0.1 mL，觀察14 d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的發(fā)病和死亡情況。參考改良寇氏（Korbor）法測(cè)定2株菌的半數(shù)致死量[9]。其計(jì)算公式為：

lgLD50＝Xk－d（Pi－0.5）

式中Xk為最大對(duì)數(shù)劑量，d為相鄰組對(duì)數(shù)劑量差值，i為分組號(hào)，Pi為死亡率。

1.3.2 優(yōu)化滅活條件和疫苗制備及安全性檢測(cè)

（1）優(yōu)化滅活條件。按1.3.1中論述的方法配置2種菌液，分別加入濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%，然后置于4℃、37℃兩種溫度下培養(yǎng)。在6、12、24、36和48 h取100 μL滅活液涂布于血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。無(wú)菌落表明細(xì)菌滅活完全徹底。觀察各種條件下平板菌落生長(zhǎng)情況，選擇所用濃度最小、滅活時(shí)間最短條件為最佳。

（2）疫苗制備。將最佳滅活條件滅活后的細(xì)菌液4000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集菌體沉積。用無(wú)菌PBS洗滌3次除去甲醛和培養(yǎng)基，最后用無(wú)菌PBS重懸。洗滌后的細(xì)菌滅活菌（4×109 CFU·mL-1）：鋁膠佐劑=4∶1（V/V）的比例通過(guò)魯爾接頭與注射器充分混勻。疫苗4℃保存。

（3）疫苗安全性檢測(cè)。將所制備的疫苗搖勻后，接種100 μL于血瓊脂平板培養(yǎng)48 h觀察有無(wú)雜菌生長(zhǎng)。結(jié)合佐劑說(shuō)明書(shū)確定免疫劑量，皮下注射100 μL、小腿肌肉注射50 μL。使用2倍免疫劑量用兩種接種方式各注射2只小鼠，觀察記錄小鼠有無(wú)不良反應(yīng)。

1.3.3 選擇最優(yōu)接種方式 取40只小鼠，每組10只，分為H20組、M20組、對(duì)照（皮下）組、對(duì)照（肌肉）組。H20組背部皮下注射（100 μL），M20組小腿肌肉注射（50 μL）接種CV20毒株滅活疫苗，對(duì)照（皮下）組、對(duì)照（肌肉）組分別接種等量無(wú)菌PBS。參考文獻(xiàn)確定免疫時(shí)間[10-11]，第14 d后進(jìn)行二免，二免疫后21 d對(duì)4組小鼠腹腔注射5LD50 CV20活菌液，攻毒后觀察14 d，觀察記錄小鼠死亡情況，計(jì)算免疫保護(hù)率（RPS），RPS=（1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）×100%[12]。

1.3.4 免疫小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn) 選取120只小鼠，分為12組，每組10只。采用小腿肌肉注射接種CV20毒株滅活疫苗，1、2、3組接種CV08毒株滅活疫苗，4、5、6組接種CV20毒株滅活疫苗，剩余6組為對(duì)照組接種等量無(wú)菌PBS。二免后21 d對(duì)免疫小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。1、2、3組攻毒CV08劑量分別為2LD50、4LD50、6LD50，7、8、9對(duì)照組攻毒CV08劑量分別為2LD50、4LD50、6LD50；4、5、6組攻毒CV20劑量分別為2LD50、4 LD50、6 D50，10、11、12對(duì)照組攻毒CV20毒株劑量分別為2LD50、4 LD50、6 LD50。攻毒后觀察14 d，觀察并記錄小鼠死亡情況。從而計(jì)算免疫保護(hù)率。

1.3.5 免疫小鼠交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn) 選取40只小鼠，分為4組，每組各10只，采用小腿肌肉注射免疫，1組接種CV08毒株滅活疫苗，2組接種CV20毒株滅活疫苗，3、4組為對(duì)照組等量注射無(wú)菌PBS。二免后21 d攻毒，對(duì)1、3組分別腹腔注射3LD50的CV20，2、4組分別腹腔注射3LD50的CV08。攻毒后觀察14 d，觀察并記錄小鼠死亡情況。從而計(jì)算免疫保護(hù)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)算CV08毒株和CV20毒株對(duì)每只小鼠的LD50分別為3.2×108、5×107 CFU。

2.2 優(yōu)化滅活條件和疫苗安全性檢測(cè)

通過(guò)探究不同甲醛濃度、作用時(shí)間及溫度對(duì)2株色桿菌菌液的滅活效果，表明甲醛濃度越大、溫度越高，被完全滅活所需的時(shí)間越短。參考文獻(xiàn)[13-14]選出最佳滅活條件為甲醛濃度0.04%、滅活時(shí)間 24 h、溫度 37℃。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、2。

滅活疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)未檢出任何活菌。肌肉注射小鼠注射部位無(wú)異常反應(yīng)吸收良好，頸部皮下注射小鼠注射部位產(chǎn)生硬結(jié)，按壓疼痛，56 d未消散，4只小鼠注射疫苗后均無(wú)異常行為，10 d后小鼠均健活。上述結(jié)果說(shuō)明本試驗(yàn)疫苗安全。

2.3 確定最優(yōu)接種方式

通過(guò)對(duì)比頸部皮下和小腿肌肉兩種免疫方式，CV20毒株滅活疫苗經(jīng)肌肉免疫可避免頸部皮下注射吸收不良，使用滅活疫苗用量相對(duì)較少的同時(shí)保護(hù)效果也更顯著。CV20毒株滅活疫苗兩種接種方式保護(hù)率對(duì)比見(jiàn)表3。

2.4 免疫小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)

通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明相較于對(duì)照組，CV08毒株滅活疫苗能產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，攻毒劑量2LD50、4LD50、6LD50的14 d內(nèi)保護(hù)率分別為83%、70%、 60%。相較于對(duì)照組，CV20毒株滅活疫苗能產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。攻毒劑量2LD50、4LD50、6LD50的14 d內(nèi)保護(hù)率分別為75%、70%、10%。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 免疫小鼠交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)

通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明2種菌株的滅活疫苗相互沒(méi)有交叉保護(hù)力。免疫小鼠交叉攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)優(yōu)化了2株色桿菌CV08毒株和CV20毒株的滅活條件。選擇鋁膠佐劑具有載體的作用，可緩慢釋放抗原，避免酶的降解，增加抗體效價(jià)[15]與滅活菌液連用制備滅活疫苗，以BALB/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物建立感染模型。CV08、CV20毒株滅活疫苗在2LD50的攻毒劑量下對(duì)小鼠的保護(hù)率為83%與75%，均能對(duì)自身菌株感染產(chǎn)生較好的保護(hù)效果。本試驗(yàn)為色桿菌滅活疫苗的深入研究提供技術(shù)參考。在CV20毒株滅活疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)攻毒劑量為6LD50時(shí)保護(hù)率僅為10%，與攻毒劑量為4LD50的保護(hù)率70%相比出現(xiàn)斷崖式的減少，可能與菌株毒力因子相關(guān)，還需進(jìn)一步研究。2種滅活疫苗無(wú)交叉保護(hù)力的情況，可能因?yàn)?種菌株為不同菌種，CV08毒株為色桿菌新種。

本試驗(yàn)通過(guò)CV20毒株滅活疫苗經(jīng)頸部皮下和后腿肌肉2種不同的免疫途徑的比較，發(fā)現(xiàn)小腿肌肉注射的保護(hù)率高于頸部皮下注射，且使用疫苗劑量更小，副作用更小，基于此本次試驗(yàn)采取后腿肌肉注射免疫。不同接種方式對(duì)血清抗體含量的影響需要建立檢測(cè)小鼠血清抗體的間接ELISA方法測(cè)定。由于課題時(shí)間限制本次試驗(yàn)未建立間接ELISA方法，后期將完善建立間接ELISA方法，用于測(cè)定免疫小鼠血清內(nèi)抗體含量，分析抗體消長(zhǎng)規(guī)律以及不同接種方式對(duì)血清抗體含量的影響，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王茜月，管飄萍，陳詩(shī)涵，等.1株溶血色桿菌的分離鑒定與基因組分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（12）：42-50.

[2]布坎南，吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè).第8版[M].北京：科學(xué)出版社， 1984：493-498.

[3]修云芳，邵良平，李碧春，等.紫色色桿菌感染小熊貓引起肺炎的臨床調(diào)查[J].獸類(lèi)學(xué)報(bào)，2011，31（1）：108-112.

[4]SADIA S， KAMAL S M.Review on Chromobacterium violaceum， a Rare but Fatal Bacteria Needs Special Clinical Attention[J].Anwer Khan Modern Medical College Journal，2019，10（2）：169-175.

[5]呂亞奎，劉輝，彭霄鵬，等.圈養(yǎng)環(huán)境下小熊貓紫色桿菌疾病診斷和防治[J].亞洲獸醫(yī)病例研究，2022，11（2）：9-15.

[6]修云芳，邵良平，王隆伯，等.小熊貓紫色色桿菌變異株感染性肺炎的臨床調(diào)查[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì).中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2009：414-417.

[7]修云芳，徐素慧，王隆柏，等.一例紫色色桿菌感染小熊貓的診治報(bào)告[J].福建畜牧獸醫(yī)，2020，42（6）：85-86.

[8]DYER N W.Chromobacteriosis in a Chinese Red Panda （Ailurus Fulgens Styani）[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2000，12（2）：177-190.

[9]孟紅亞.Bliss法測(cè)定YLN1415對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD50）[J].凱里學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，35（3）：104-107.

[10]陶喬孝慈，鄔琴，顧曉曉，等.牛源A型多殺性巴氏桿菌（Pm12）滅活疫苗的制備及小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2021（5）：127-130，135.

[11]牟婧.牛源致病性大腸桿菌菌影制備及其免疫原性研究[D].黑龍江：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[12]趙山.羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌弱毒和滅活疫苗保護(hù)效果的比較研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

[13]李正偉.維氏氣單胞菌滅活疫苗的制備及其免疫保護(hù)效應(yīng)研究[D].重慶：西南大學(xué)，2014.

[14]陳皓祥.花鱸哈維弧菌甲醛滅活疫苗的制備及其保護(hù)力研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2021.

[15]楊琳，傅哲彥，呂正兵，等.免疫佐劑分類(lèi)及作用機(jī)制[J].中國(guó)生物工程雜志，2019，39（5）：114-119.

（責(zé)任編輯：柯文輝）