回交改良中粳616抗除草劑性狀

楊東 駱名瑞 石義濤 謝蘭宇

摘 要：除草劑的使用會(huì)降低水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，開(kāi)展非轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻品種改良迫在眉睫。以中粳616（受體材料）及抗除草劑品種金粳818、凈田美占為試驗(yàn)材料，經(jīng)除草劑（先達(dá)豆施樂(lè)，5%咪唑乙煙酸含量）濃度梯度試驗(yàn)篩選抗除草劑處理濃度，通過(guò)雜交、回交、自交結(jié)合除草劑耐藥性篩選獲得中粳616-TR，進(jìn)一步分析除草劑對(duì)改良后中粳616-TR幼苗萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響，同時(shí)以中粳616為對(duì)照進(jìn)行品比試驗(yàn)。結(jié)果表明：除草劑濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示，可將3 mL·L-1作為后續(xù)抗除草劑水稻篩選濃度。改良獲得的中粳616-TR在3 mL·L-1濃度除草劑處理下，在萌發(fā)期和苗期對(duì)除草劑均有耐藥性，品比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中粳616-TR在農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、抗病性、品質(zhì)方面與中粳616無(wú)顯著差異。綜上，改良后的中粳616-TR具有品質(zhì)優(yōu)、稻瘟病抗性好、產(chǎn)量高兼?zhèn)淇钩輨┬誀畹忍攸c(diǎn)。

關(guān)鍵詞：粳稻；中粳616；輕簡(jiǎn)化栽培；抗除草劑；回交改良

中圖分類(lèi)號(hào)：S 511? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2023）03-0056-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.010

Abstract： The use of herbicides would reduce the yield and quality of rice. It was urgent to improve the nontransgenic herbicidetolerant rice varieties. Zhongjing 616 （receptor material） and the herbicidetolerant varieties， such as Jinjing 818 and Jingtian Meizhan， were selected as the experimental materials， and the concentration gradient test of herbicide （Xianda Doushile， 5% imidazoic acid content） was used to screen the herbicidetolerant treatment concentrations. Zhongjing 616-TR was obtained through the hybridization， backcrossing and selfcrossing combined with the screening of herbicide resistance. The effects of herbicides on the seedling germination and growth of the improved Zhongjing 616-TR were further analyzed. At the same time， Zhongjing 616 was used as the control group to carry out the variety comparison test. The results showed that the herbicide concentration gradient experimentation results showed that 3 mL·L-1 could be used as the followup screening concentration of herbicidetolerant rice. The improved Zhongjing 616-TR was resistant to herbicides at the germination stage and the seedling stage when treated with 3 mL·L-1 herbicide. The variety comparison test showed that there was no significant difference in the agronomic traits， yield， disease resistance and quality between Zhongjing 616-TR and Zhongjing 616. In summary， the improved Zhongjing 616-TR had the characteristics of excellent quality， good rice blast resistance， high yield and herbicide resistance.

Key words： Japonica rice； Zhongjing 616； Light and simplified cultivation； Herbicide resistance； Backcross improvement

雜草對(duì)水稻的產(chǎn)量及品質(zhì)有很大危害，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)[1]。稻田雜草通過(guò)與水稻植株競(jìng)爭(zhēng)生存空間和養(yǎng)分、水、光資源，影響水稻田的微生態(tài)環(huán)境，以增加稻田病蟲(chóng)害的發(fā)生幾率，進(jìn)一步導(dǎo)致水稻不同程度地減產(chǎn)并影響稻米品質(zhì)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于雜草的侵害造成了我國(guó)水稻產(chǎn)量損失達(dá)15%左右[3]。近年來(lái)，隨著我國(guó)水稻輕簡(jiǎn)化栽培快速發(fā)展，免耕和直播稻田雜草的危害日益突出[4-5]。化學(xué)除草是農(nóng)田雜草防除的主要手段[6]。然而增加除草劑的使用不僅會(huì)降低作物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和品質(zhì)而且對(duì)生態(tài)環(huán)境會(huì)造成一定影響，其用藥劑量過(guò)高、施藥時(shí)期不當(dāng)、用藥時(shí)的環(huán)境條件不良等因素都會(huì)使作物產(chǎn)生藥害[7-8]。除草劑若使用不當(dāng)造成藥害，對(duì)作物的脅迫會(huì)更加嚴(yán)重，對(duì)產(chǎn)量的影響更大。所以，使用除草劑在注重雜草防除效果的同時(shí)，更要重視其對(duì)作物產(chǎn)量的影響[9]。因此，水稻育種家和種業(yè)公司已越來(lái)越重視水稻抗除草劑性狀的改良。目前我國(guó)尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化種植，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗除草劑水稻將無(wú)法商業(yè)化，培育和改良非轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻品種迫在眉睫。

近年來(lái)中國(guó)科學(xué)家利用誘變等方法篩選乙酰乳酸合成酶（ALS）變異基因的抗除草劑種質(zhì)，例如江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變技術(shù)，篩選出對(duì)甲咪唑煙酸敏感度低的多個(gè)粳稻、秈稻品種，篩選到多個(gè)抗除草劑突變體[10-12]。深圳興旺生物種業(yè)有限公司用EMS誘變黃絲占和黃華占，獲得了3個(gè)對(duì)咪唑啉酮類(lèi)除草劑抗性的突變體[13]?？钩輨┧窘鹁?18是天津市水稻所利用津稻9618和津稻1007雜交，經(jīng)多年系譜法選育而成的常規(guī)粳稻品種，在種質(zhì)資源開(kāi)展除草劑篩選試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其具有咪唑啉酮除草劑抗性，由于近年來(lái)水稻輕簡(jiǎn)化直播技術(shù)迅速發(fā)展，此品種受到較好的應(yīng)用推廣[14]。然而國(guó)內(nèi)抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑水稻育種進(jìn)程緩慢，現(xiàn)有育成抗除草劑水稻品種的數(shù)量及類(lèi)型不能滿(mǎn)足水稻市場(chǎng)及推廣應(yīng)用的需要，抗除草劑水稻品種的育種進(jìn)程得急需加快。

中粳616具有豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性好、優(yōu)質(zhì)、中抗稻瘟病等特點(diǎn)，2018年通過(guò)國(guó)家審定，獲江蘇省2019年度優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)評(píng)鑒獎(jiǎng)金獎(jiǎng)。本研究前期通過(guò)除草劑濃度梯度試驗(yàn)，篩選出水稻適宜的除草劑處理濃度，進(jìn)一步以非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻材料金粳818為供體材料，以中粳616為受體材料，利用雜交、連續(xù)回交和除草劑耐藥性篩選相結(jié)合的技術(shù)路線，獲得新改良“中粳616-TR”抗除草劑材，旨在為水稻抗除草劑育種提供新思路和新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以中粳616、金粳818、凈田美占為試驗(yàn)材料，其中金粳818、凈田美占屬于抗除草劑材料[13-14]，種子由中國(guó)種子集團(tuán)有限公司江蘇分公司提供。

1.2 供試除草劑

除草劑為先達(dá)豆施樂(lè)，5%咪唑乙煙酸含量，由山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司提供。該除草劑屬于咪唑啉酮類(lèi)除草劑，是使用較廣的除草劑之一，具備譜廣滅殺雜草、用量低、殺草效率高等優(yōu)勢(shì)，深受大眾青睞[15]。

1.3 除草劑濃度梯度篩選試驗(yàn)

試驗(yàn)于2018年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所福州市城門(mén)鄉(xiāng)連坂村進(jìn)行。（1）以中粳616、金粳818、凈田美占為試驗(yàn)材料，每個(gè)品種挑出飽滿(mǎn)種子100粒，3次重復(fù)。分別設(shè)置0、10、50、100、150、200?mL·L-1濃度除草劑浸種處理12 h，再換清水浸種12 h，進(jìn)行催芽，培養(yǎng)10 d，調(diào)查發(fā)芽率和成苗率。（2）前期梯度試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為篩選抗除草劑品種的藥劑濃度應(yīng)在10 mL·L-1以下。以中粳616、金粳818、凈田美占為試驗(yàn)材料，每個(gè)品種挑出飽滿(mǎn)種子100粒，3次重復(fù)。分別設(shè)置0、1、3、5、7、9 mL·L-1濃度除草劑浸種處理12 h，再換清水浸種12 h，進(jìn)行催芽，培養(yǎng)10 d，調(diào)查發(fā)芽率和成苗率，確定最終除草劑處理濃度。

1.4 雜交、回交、自交結(jié)合除草劑耐藥性篩選獲得中粳616-TR

于2019年春至2021年夏在三亞、沙縣兩地，一年三代雜交、回交、自交。除草劑耐藥性篩選濃度均設(shè)置為3 mL·L-1。

1.5 中粳616-TR抗除草劑性狀驗(yàn)證

（1）種子萌發(fā)試驗(yàn)。以中粳616-TR和中粳616（對(duì)照）為材料，分別挑出飽滿(mǎn)種子100粒，3次重復(fù)，在種子萌發(fā)期，分別用濃度3 mL·L-1除草劑浸種處理12 h，再換清水浸種12 h，進(jìn)行催芽，培養(yǎng)10 d，調(diào)查發(fā)芽率和成苗率。（2）苗期生長(zhǎng)試驗(yàn)。以中粳616-TR和中粳616（對(duì)照）為材料，在苗期分別挑選100株幼苗，3次重復(fù)，分別用濃度3 mL·L-1除草劑噴施水稻幼苗，調(diào)查水稻苗期生長(zhǎng)情況。

1.6 改良后中粳616-TR的田間表現(xiàn)

于2021-2022年秋在江蘇洪澤，以中粳616為對(duì)照，考察改良后中粳616-TR的田間表現(xiàn)。5葉齡移栽，單本插栽40行，每行10株，株行距16.7 cm×20.0 cm，3次重復(fù)。土壤肥力中等偏上，地力均勻，肥水管理與病蟲(chóng)害防治與大田生產(chǎn)相同。考查水稻的成熟期、株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、產(chǎn)量、抗性以及稻米品質(zhì)（參照NY/T 593-2013《米質(zhì)測(cè)定方法》）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，以SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草劑濃度梯度篩選試驗(yàn)結(jié)果

從表1可見(jiàn)，在0 mL·L-1濃度處理下，中粳616、金粳818、凈田美占均能正常發(fā)芽成苗，發(fā)芽率和成苗率均在85%以上；在10 mL·L-1濃度處理下，中粳616、金粳818、凈田美占均能正常發(fā)芽，發(fā)芽率均在85%以上，但未能成苗；在50、100、150、200 mL·L-1濃度處理下，中粳616、金粳818、凈田美占均未能發(fā)芽，更無(wú)法成苗；初步認(rèn)為篩選抗除草劑品種的藥劑濃度應(yīng)在10 mL·L-1以下。

進(jìn)一步縮小除草劑濃度范圍，開(kāi)展?jié)舛群Y選試驗(yàn)。由表2可見(jiàn)，在0 mL·L-1濃度處理下，中粳616、金粳818、凈田美占均能正常發(fā)芽成苗，發(fā)芽率和成苗率均在85%以上；在1、3 mL·L-1濃度處理下，中粳616、金粳818、凈田美占均能發(fā)芽，發(fā)芽率均在85%以上，僅中粳616未能成苗，其余品種均能正常成苗，成苗率均在85%以上；在5、7、9 mL·L-1濃度處理下，中粳616、金粳818、凈田美占均能發(fā)芽，發(fā)芽率均在85%以上，但未能成苗。試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選抗除草劑品種的藥劑濃度應(yīng)在1～3 mL·L-1。1～3 mL·L-1濃度除草劑對(duì)非轉(zhuǎn)基因常規(guī)水稻即可產(chǎn)生致死，但抗除草劑品種能正常成苗。因此，將3 mL·L-1作為抗除草劑水稻篩選濃度。

2.2 抗除草劑改良系中粳616-TR選育過(guò)程

2019年春在三亞以中粳616為母本與非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻材料金粳818為父本進(jìn)行雜交，2019年夏在三亞利用3 mL·L-1濃度除草劑處理得到真雜種F1與中粳616回交（下面使用除草劑濃度均為3 mL·L-1），收獲回交種200粒以上；2019年秋在沙縣回交種BC1F1通過(guò)除草劑處理后種植成小區(qū)，選擇田間農(nóng)藝形態(tài)相似的單株繼續(xù)與中粳616回交，收獲雜交種200粒以上；2020年春在三亞回交種BC2F1通過(guò)除草劑處理后種植成小區(qū)，選擇田間農(nóng)藝形態(tài)相似的單株，繼續(xù)與中粳616回交，收獲雜交種200粒以上；2020年夏在三亞BC3F1通過(guò)除草劑處理后種植成小區(qū)，收獲田間表型與親本中粳616一致的單株自交種。2020年秋至2021年夏，經(jīng)三亞、沙縣一年三代自交加代，獲得抗除草劑、農(nóng)藝形態(tài)與中粳616表型一致的小區(qū)，命名為中粳616-TR，回交改良過(guò)程見(jiàn)圖1。

2.3 中粳616-TR抗除草劑性狀驗(yàn)證

由表3可知，在種子萌發(fā)期，在3 mL·L-1濃度除草劑處理下，中粳616-TR能正常發(fā)芽和成苗，對(duì)照中粳616能正常發(fā)芽，但未能成苗。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苗期在3 mL·L-1濃度除草劑噴施下，中粳616-TR能正常生長(zhǎng)，對(duì)照中粳616未能正常生長(zhǎng)導(dǎo)致枯死。結(jié)果表明，在萌發(fā)期和苗期中粳616-TR對(duì)除草劑均有耐藥性。

2.4 改良后中粳616-TR的田間表現(xiàn)

2.4.1 主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量 從表4可知，2021、2022年中粳616-TR全生育期分別為147.0、146.0 d，株高分別為102.0、98.5 cm，有效分蘗數(shù)分別為10.6、11.2個(gè)·叢-1，穗長(zhǎng)分別為15.6、16.8 cm，每穗總粒數(shù)分別為152.0、155.0粒，結(jié)實(shí)率分別為89.0%、90.0%，千粒重分別為27.0、26.4 g，產(chǎn)量分別為11.6、11.8 t·hm-2，兩年農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量中粳616-TR與對(duì)照中粳616未有顯著差異。

2.4.2 稻米品質(zhì) 2021、2022年經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所檢測(cè)，中粳616-TR出糙率分別為84.0%、83.0%，整精米率分別為70.1%、70.5%，直鏈淀粉含量分別為16.3%、16.1%，膠稠度分別為75、78 mm，堊白粒率分別為15.0%、14.0%，堊白度分別為4.0%、4.3%，長(zhǎng)寬比均為1.8，主要品質(zhì)指標(biāo)與對(duì)照中粳616相比差異不顯著，均達(dá)到NY/T 593-2013《食用稻品種品質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)三級(jí)。

2.4.3 抗病性 2021、2022年在湖北恩施進(jìn)行稻瘟病田間鑒定，中粳616-TR稻瘟病綜合抗性指數(shù)分別為3.5、3.8，兩年穗頸瘟損失率最高級(jí)均為3級(jí)，兩年均為中抗（MR）稻瘟病，與對(duì)照中粳616基本上一致（表6）。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)美國(guó)RiceTec公司主推的抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑水稻品種有Clearfield XL729、Clearfield XL745、Clearfield XP756 和 Clearfield XP4534，屬于非轉(zhuǎn)基因雜交水稻。在美國(guó)和中南美洲廣泛種植抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑水稻，其市場(chǎng)份額占76%美國(guó)雜交水稻市場(chǎng)，占90%中南美洲市場(chǎng)[16]。本研究通過(guò)對(duì)中粳616回交改良除草劑試驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)海南三亞、福建沙縣兩地，一年三代，可實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)的定向回交改良，縮短育種進(jìn)程，發(fā)揮綜合技術(shù)育種優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)種質(zhì)創(chuàng)制進(jìn)程。在當(dāng)前我國(guó)嚴(yán)格監(jiān)管轉(zhuǎn)基因水稻的背景下，非轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻具有廣闊的應(yīng)用前景。

吳云雨等[17]研究表明，抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑水稻種質(zhì)是由于乙酰乳酸合成酶（ ALS） 發(fā)生堿基突變，引起蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，減弱對(duì)咪唑啉酮類(lèi)除草劑的敏感程度。前人對(duì)ALS基因分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、堿基位點(diǎn)突變變異等分子方面有較多的研究。鮮有咪唑啉酮類(lèi)除草劑對(duì)抗除草劑水稻和常規(guī)水稻耐藥性表型影響的研究。鄒拓等[18]研究認(rèn)為抗除草劑水稻與常規(guī)水稻種子、根和葉片對(duì)除草劑耐藥性響應(yīng)存在差異，在種子萌發(fā)期及苗期利用表型篩選，對(duì)具有抗除草劑基因后代材料完成快速選擇。其方法是用0.03%咪唑乙煙酸溶液浸泡水稻種子72 h，或在水稻3葉1心期用0.07%咪唑乙煙酸溶液噴施，不具有除草劑基因的后代材料均被殺死。本研究進(jìn)行除草劑梯度和篩選試驗(yàn)，結(jié)果表明，除草劑濃度3 mL·L-1（先達(dá)豆施樂(lè)，5%咪唑乙煙酸含量）浸種12 h可作為非轉(zhuǎn)基因水稻抗除草劑篩選濃度。前人在棉花種子和谷子上用除草劑溶液浸種，通過(guò)種子萌發(fā)期篩選品種除草劑抗性，此方法效果顯著，較分子標(biāo)記輔助選擇效率更高，在正常的種子萌發(fā)期即可對(duì)抗性材料完成篩選[19-20]。本研究結(jié)果明確了水稻種子萌發(fā)期篩選非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻的除草劑處理濃度，有利于提高抗除草劑水稻的育種效率。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）