益氣活血通絡(luò)方聯(lián)合針刺對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)Nav1.7和Nav1.8表達(dá)的影響

程 凱,陳 前,袁慧倫,程連芝,江愛娟

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,安徽 合肥 230012)

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會的最新數(shù)據(jù)[1-2],2021年全球成年人(20～79歲)患有糖尿病者有5.37億,且約25%糖尿病患者最終伴發(fā)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain,DNP)。DNP是以感覺障礙,自發(fā)性疼痛,四肢燒灼樣疼痛、刺痛,溫痛覺超敏為臨床特征,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。背根神經(jīng)節(jié)是疼痛的反應(yīng)中樞。在DNP的發(fā)展過程中,各種外周刺激可使離子通道表達(dá)水平發(fā)生改變,導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)過度興奮,從而引起疼痛[4]。研究表明,背根神經(jīng)節(jié)中電壓門控鈉通道1.7(Nav1.7)和Nav1.8參與痛覺的發(fā)生和傳導(dǎo)。外周神經(jīng)損傷時,神經(jīng)的自發(fā)性動作電位和異常的高頻活動導(dǎo)致Nav1.7和Nav1.8在背根神經(jīng)節(jié)中高度表達(dá),Nav1.7和Nav1.8表達(dá)水平升高可以擴(kuò)大疼痛信號,增強(qiáng)疼痛傳導(dǎo)[5]。針?biāo)幗Y(jié)合是臨床上治療疾病的常用方法,可以提升療效,減少藥物不良反應(yīng)[6]。前期研究[7-8]表明,益氣活血通絡(luò)方和針刺治療可以有效緩解DNP大鼠的疼痛癥狀,減輕大鼠疼痛反應(yīng)。因此,本研究旨在觀察針?biāo)幗Y(jié)合對DNP大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8表達(dá)的影響,為臨床治療DNP提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 58只SPF級SD大鼠,體質(zhì)量180～210 g,購自江蘇省南京青龍山動物繁殖場[生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2019-0002]。所有大鼠自由飲食,飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、濕度25%～30%環(huán)境下。實驗動物倫理編號為AHUCM-rats-2020031。

1.2 藥物與試劑 益氣活血通絡(luò)方(黃芪30 g,雞血藤15 g,生地黃、當(dāng)歸、葛根各 12 g,延胡索、威靈仙各9 g;安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,批號20220418);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ;批號EZ3414B220):德國BioFroxx公司;BCA(批號 PICPI23223):德國賽默飛世爾科技公司;Nav1.7(批號 252100):美國ZEN Bio公司;Nav1.8(批號 ab63331):英國Abcam公司。

1.3 儀器 血糖儀(5D-2型):北京怡成生物電子技術(shù)有限公司;智能熱板儀(RB200):成都泰盟軟件有限公司;Electric von Frey電子測痛儀(2392型):美國IITC公司;PowerPacUniversal通用電泳儀:美國伯樂公司;實時熒光定量PCR儀(7500型):美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon-5200):上海天能科技有限公司;冰凍切片機(jī)(CM1850):德國徠卡公司;熒光顯微鏡(ECLIPSE Ni):日本尼康公司。

2 方法

2.1 DNP模型復(fù)制 參照文獻(xiàn)[9-10]的方法,將58只雄性SPF級SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)選取9只作為空白組,普通飼料喂養(yǎng),其余大鼠使用高脂飼料喂養(yǎng)4周,使之產(chǎn)生胰島素抵抗。4周后單次腹腔注射STZ(35 mg/kg),72 h后,測量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG≥11.1 mmol/L判定為2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)模型大鼠。2周后檢測T2D大鼠的機(jī)械痛閾(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足反應(yīng)時間(thermal withdrawal latency,TWL),若MWT下降至基礎(chǔ)值85%以下,且TWL減少至基礎(chǔ)值85%以下,則判定為DNP模型大鼠。

2.2 動物分組及治療 將DNP模型大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組、中藥組與針?biāo)幗Y(jié)合組,每組9只?？瞻捉M不作處理;模型組給予生理鹽水灌胃;針刺組參照大鼠的解剖定位,對比人體的穴位分布,選取“足三里”穴每日進(jìn)行針刺治療,針刺20 min;中藥組用益氣活血通絡(luò)方(9 g/kg)灌胃治療,每日1次;針?biāo)幗Y(jié)合組采用益氣活血通絡(luò)方和針刺“足三里”穴聯(lián)合治療,在灌胃后進(jìn)行針刺,每日1次,方法同上。

2.3 MWT測定 將各組大鼠放置于篩狀金屬板上,用有機(jī)玻璃罩分隔開,靜息30 min。然后用Electric von Frey電子測痛儀垂直刺激大鼠后掌底,當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足或者躲避時儀器上所顯示的數(shù)值,即為MWT。連續(xù)測4次,每次測量間隔15 s,取其平均值。每周測定1次。

2.4 TWL測定 提前將熱板測痛儀預(yù)熱至52 ℃,將大鼠放入其中。當(dāng)大鼠足部接觸熱板開始計時,當(dāng)大鼠出現(xiàn)舔后足時停止計時,每只大鼠重復(fù)測定3次,每次測定間隔時間為5 min,其平均值即為TWL。每周測定1次。

2.5 樣本采集和處理 實驗結(jié)束后,對大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。然后固定俯臥位,用外科剪刀和手術(shù)刀分出大鼠脊柱,從腰骶膨大處手術(shù)切出L4—L6段,然后用眼科剪及鑷子取出大鼠背根神經(jīng)節(jié)并保存在-80 ℃冰箱。

2.6 Western blot法檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8蛋白表達(dá)水平 使用蛋白質(zhì)提取試劑盒從背根神經(jīng)節(jié)組織中提取總細(xì)胞蛋白,并使用BCA試劑盒測量濃度。用10% PAGE電泳分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后在5%脫脂奶粉中封閉2 h后,將膜與Nav1.7、Nav1.8、β-actin在4 ℃下孵育過夜,然后室溫下二抗孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光液并在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

2.7 qRT-PCR法檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平 使用Trizol提取大鼠背根神經(jīng)節(jié)中總RNA,測定RNA純度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用SYBR法進(jìn)行擴(kuò)增,檢測Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平,最后用2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達(dá)水平。本實驗所使用的引物序列:

β-actin正向引物:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′;β-actin反向引物:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′;Nav1.7正向引物:5′-CGCTGCTGAGTTCAC-GAGTATAGG-3′;Nav1.7反向引物:5′-CGGTTTCTTCTCTCCTTGGCACTC-3′;Nav1.8正向引物:5′-CTTTCCCGCCATCCTATGACAGTG-3′;Nav1.8反向引物:5′-CTTCCTTAGCAGC-GACCTCATCTTC-3′。

2.8 免疫熒光法檢測背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8表達(dá)水平 將L4—L6背根神經(jīng)節(jié)在10%組織固定液中固定,隨后將組織通過蔗糖梯度溶液脫水,包埋組織,通過切片機(jī)將組織切片。用10%山羊血清封閉30 min,并與一抗(Nav1.7、Nav1.8)在4 ℃下孵育過夜,再將載玻片與二抗(山羊抗兔IgG)室溫下孵育1 h,載玻片添加DAPI孵育5 min。載玻片用抗熒光淬滅固定介質(zhì)固定,并用熒光顯微鏡觀察Nav1.7、Nav1.8的表達(dá)情況,使用Image J(1.8.0)計算Nav1.7、Nav1.8的熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 不同時點5組大鼠MWT、TWL比較 與空白組比較,治療前模型組大鼠MWT、TWL均顯著降低(P<0.05);治療1周后,與空白組比較,模型組、針刺組、用藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組MWT持續(xù)降低,TWL持續(xù)縮短;治療2、3、4周后,與模型組比較,中藥組、針刺組、針?biāo)幗Y(jié)合組MWT顯著升高,TWL顯著延長(P<0.05),且針?biāo)幗Y(jié)合組MWT、TWL顯著高于中藥組和針刺組(P<0.05)。見圖1。

注:A.空白組;B.模型組;C.針刺組;D.中藥組;E.針?biāo)幗Y(jié)合組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與針刺組比較,△P<0.05;與中藥組比較,◇P<0.05圖1 5組大鼠MWT、TWL比較

3.2 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8蛋白表達(dá)水平比較 治療4周后,與空白組比較,模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中Nav1.7、Nav1.8蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,針刺組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中Nav1.7、Nav1.8蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中Nav1.7、Nav1.8蛋白表達(dá)水平顯著低于中藥組和針刺組(P<0.05)。見圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C.針刺組;D.中藥組;E.針?biāo)幗Y(jié)合組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與針刺組比較,△P<0.05;與中藥組比較,◇P<0.05圖2 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8蛋白表達(dá)水平比較

3.3 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平比較 與空白組比較,模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05);與模型組比較,針刺組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平顯著低于針刺組和中藥組(P<0.05)。見圖3。

注:A.空白組;B.模型組;C.針刺組;D.中藥組;E.針?biāo)幗Y(jié)合組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與針刺組比較,△P<0.05;與中藥組比較,◇P<0.05圖3 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表達(dá)水平比較

3.4 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8熒光表達(dá)水平比較 與空白組比較,模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8的熒光表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);與模型組比較,針刺組、中藥組和針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8熒光表達(dá)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8熒光表達(dá)水平顯著低于針刺組和中藥組(P<0.05)。見圖4。

注:大鼠背根神經(jīng)節(jié)的免疫熒光染色結(jié)果(10×50倍,藍(lán)色代表DAPI,綠色代表Nav1.7、Nav1.8);A.空白組;B.模型組;C.針刺組;D.中藥組;E.針?biāo)幗Y(jié)合組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與針刺組比較,△P<0.05;與中藥組比較,◇P<0.05圖4 5組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7、Nav1.8熒光表達(dá)水平比較

4 討論

DNP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,西醫(yī)治療的效果不理想,而針?biāo)幗Y(jié)合治療DNP的效果明顯,是治療DNP的重要方法[11]。DNP可歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”“痹證”范疇,因消渴日久,陰虛內(nèi)熱,瘀血阻滯而成[12]。益氣活血通絡(luò)方是臨床治療DNP的有效驗方。臨床研究[13-14]表明,該方可以降低血液黏稠度,改善微循環(huán),調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌和炎癥因子,從而有效緩解糖尿病神經(jīng)病變患者疼痛癥狀。課題組前期研究[15]表明,益氣活血通絡(luò)方可以改善DNP大鼠微循環(huán),降低血脂水平,減輕脊髓神經(jīng)炎癥反應(yīng),對抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生,進(jìn)而緩解DNP大鼠疼痛癥狀。針灸對疼痛具有獨特療效[16]。足三里穴是臨床治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的常用穴位,為足陽明經(jīng)合穴,針刺足三里治療DNP起到活血通絡(luò)、除痹止痛的作用。臨床研究[17]表明,針刺足三里可以有效緩解糖尿病周圍神經(jīng)病變導(dǎo)致的疼痛,改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度。課題組前期研究[7]表明,針刺足三里可以通過改善DNP大鼠炎癥反應(yīng),緩解疼痛癥狀。針?biāo)幗Y(jié)合是常用的中醫(yī)治療方法,早在《素問·移精變氣論》就有“毒藥治其內(nèi),針石治其外”的記載,針?biāo)幗Y(jié)合因其療效顯著,被歷代中醫(yī)大家所尊崇。中藥內(nèi)服可以調(diào)整人體的陰陽平衡和改善臟腑氣血生理功能,外用針灸可以疏通經(jīng)絡(luò),調(diào)整氣血運(yùn)行方式,從而達(dá)到通經(jīng)止痛的目的[18]。針?biāo)幗Y(jié)合可以通過內(nèi)外同治達(dá)到糾正人體氣血陰陽失衡,改善全身狀態(tài),進(jìn)而發(fā)揮治療疾病的作用。本實驗根據(jù)課題組前期方法構(gòu)建DNP大鼠模型,與空白組比較,模型組大鼠MWT顯著降低,TWL顯著縮短。而經(jīng)過益氣活血通絡(luò)方、針刺、針?biāo)幗Y(jié)合3種治療方式干預(yù)后,3組大鼠MWT先下降后逐漸回升,TWL先縮短再逐漸延長,說明3種治療方式都可以緩解DNP大鼠的疼痛癥狀。而針?biāo)幗Y(jié)合組與益氣活血通絡(luò)方組和針刺組比較,DNP大鼠MWT顯著回升,TWL顯著延長,說明針?biāo)幗Y(jié)合相較于單純用藥和單純針刺而言,更能緩解DNP大鼠的疼痛癥狀。

背根神經(jīng)節(jié)參與神經(jīng)病理性疼痛的治療機(jī)制,而Nav1.7和Nav1.8在背根神經(jīng)節(jié)中高度表達(dá),在背根神經(jīng)節(jié)動作電位的傳導(dǎo)過程中占主導(dǎo)作用[19]。研究[20]表明,在神經(jīng)病理性疼痛中,Nav1.7和Nav1.8的表達(dá)水平增高與疼痛的程度呈正相關(guān),而通過抑制Nav1.7和Nav1.8的表達(dá),可以起到很好的鎮(zhèn)痛作用。DNP模型大鼠的痛覺過敏,同時伴隨背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8增加,而通過干預(yù)手段降低背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8的表達(dá)水平,可以有效緩解DNP大鼠的疼痛[21]。劉鵬等[22-23]的研究證明,中藥可以改變背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8表達(dá),從而緩解糖尿病病理性疼痛。Liao等[24]和Yen等[25]發(fā)現(xiàn),針刺足三里可以改變神經(jīng)疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8表達(dá),進(jìn)而改善大鼠疼痛癥狀。在本實驗中,與空白組比較,模型組大鼠背跟神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8表達(dá)水平顯著升高,說明Nav1.7和Nav1.8參與DNP發(fā)生發(fā)展,這與Chattopadhyay等[21]的實驗結(jié)果一致。而經(jīng)過益氣活血通絡(luò)方、針刺、針?biāo)幗Y(jié)合3種治療方式干預(yù)后,大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8的表達(dá)水平顯著降低;而針?biāo)幗Y(jié)合組與中藥組和針刺組比較,Nav1.7和Nav1.8的表達(dá)進(jìn)一步降低,說明針?biāo)幗Y(jié)合能進(jìn)一步降低大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8的表達(dá)水平。

綜上所述,益氣活血通絡(luò)方聯(lián)合針刺可有效緩解大鼠DNP,且效果優(yōu)于單純針刺和益氣活血通絡(luò)方,其作用機(jī)制可能與其抑制背根神經(jīng)節(jié)中Nav1.7和Nav1.8的表達(dá)有關(guān)。DNP的機(jī)制復(fù)雜,針?biāo)幗Y(jié)合是否還可以通過其他通路來影響DNP還需要進(jìn)一步探究。