基于色度、有效成分相關(guān)性的蒲黃炒炭識別模式

劉敏潔,黃 琪,2,吳德玲,2,趙宏蘇,金傳山,2,許鳳清,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地, 安徽 合肥 230038)

蒲黃(PollenTyphae)為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.、東方香蒲TyphaorientalisPresl或同屬植物的干燥花粉,具有止血、化瘀、通淋之功效[1]。蒲黃中主要化學(xué)成分有黃酮類、甾醇類、烷烴類、有機(jī)酸類等,具有止血、抗血栓形成、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2-4]。蒲黃炭(PollenTyphaeCarbonisata)是中醫(yī)臨床常用品種,由蒲黃按炒炭法炒制成棕褐色或黑褐色。蒲黃因質(zhì)地疏松,炒炭過程中受溫度、投料量、翻炒頻率及炒制時間等因素的影響,難以把握其準(zhǔn)確的炮制程度,容易造成飲片炮制“不及”或“太過”,影響藥材質(zhì)量及臨床療效。隨著色差儀在中藥領(lǐng)域質(zhì)量控制中的應(yīng)用[5-8],Ren等[9]用其成功區(qū)分干燥箱制備的3種不同程度的蒲黃炭。目前,關(guān)于傳統(tǒng)炮制工藝炮制的蒲黃炭及其整個炒炭過程中飲片顏色和成分含量變化的關(guān)聯(lián)性未見報道。本研究采用傳統(tǒng)炮制工藝制備蒲黃炭,測定不同炮制程度蒲黃炭有效成分含量及色度值,結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析方法,對蒲黃炭炮制過程中外觀顏色與內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)性分析,為蒲黃炭的炮制識別模式提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 SHIMADZU-LC-2030C高效液相色譜儀(自動進(jìn)樣器SIL-20AC,二極管陣列檢測器SPD-20AV,柱溫箱CTO-20AC,色譜工作站):日本島津公司;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美國安捷倫科技有限公司;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器:江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;十萬分之一電子天平(AB135-S):瑞士梅特勒-托利多公司;色差儀(IRIS VA400視覺分析儀):法國ALPHA M.O.S公司。

香蒲新苷對照品(批號 MUST-20081902,純度 99.42%)、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品(批號 MUST-20082104,純度 99.45%):四川省成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純):上海躍勝貿(mào)易有限公司;冰醋酸(分析純):上海阿拉丁生化科技有限公司;超純水:浙江娃哈哈宏振飲用水有限公司。

1.2 藥材 9批蒲黃藥材來源信息見表1,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山副教授鑒定為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.的干燥花粉。

表1 蒲黃基本信息表

2 方法

2.1 蒲黃藥材指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取生蒲黃0.5 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)提取30 min,放冷,再稱質(zhì)量,以提取溶劑補(bǔ)足所減失的質(zhì)量,過濾,濾液過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取香蒲新苷對照品、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品適量,精密稱定,置10 mL容量瓶中加入70%甲醇,溶解,定容至刻度線,制成每毫升含有香蒲新苷0.259 mg、異鼠李素-3-O-新橙皮苷0.263 mg的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;流速:1.0 mL/min;以0.2%冰醋酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min,5%～10% B;5～15 min,10%～14% B;15～35 min,14% B;35～40 min,14%～20% B;40～55 min,20%～24% B;55～60 min,24%～35% B;60～65 min,35%～40% B;65～67 min,40%～5% B)。

2.1.4 蒲黃藥材指紋圖譜的建立 取9批蒲黃藥材,按照“2.1.1”中方法制備成供試品溶液,按照“2.1.3”中色譜條件進(jìn)行測定。將所測得的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”,對蒲黃藥材進(jìn)行色譜峰匹配,以中位數(shù)矢量法生成對照圖譜(R),并計算與對照圖譜R的相似度。

2.2 蒲黃中有效成分含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取混合對照品溶液依次稀釋,制成含香蒲新苷259 μg/mL→4.05 μg/mL,異鼠李素-3-O-新橙皮苷263 μg/mL→4.11 μg/mL等7個不同濃度的混合對照品溶液。精密吸取20 μL,依法測定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。依據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》,進(jìn)行精密度(對照品混合溶液)、穩(wěn)定性(S4)、重復(fù)性(S4)和準(zhǔn)確度(S4)試驗。

2.2.2 含量測定 取9批不同批次的蒲黃藥材適量,依照上述“2.1.1”中方法制備成供試品溶液,按照上述“2.1.3”色譜條件進(jìn)行測定。

2.3 顏色測定

2.3.1 不同程度蒲黃炭飲片樣品的制備 取蒲黃藥材9批(編號S1—S9),按照2020年版《中華人民共和國藥典》(通則0213)中炒炭法[1]制備蒲黃炭,炮制過程中,通過測溫槍測得鍋中溫度為160～200 ℃時,取蒲黃藥材至熱鍋內(nèi),每隔65 s 取樣1次,分別制成不同程度蒲黃炭。在此炮制過程中,取樣編號記作TP(代表生蒲黃)和TPC1—TPC6(分別代表6種炮制程度的蒲黃炭),備用。見圖1。

圖1 生蒲黃(TP)和不同炮制程度蒲黃炭(TPC1—TPC6)飲片

2.3.2 色彩分析儀參數(shù)設(shè)置 開啟IRIS VA400型視覺分析儀,開始預(yù)熱,待指示燈顯示綠燈時,表示預(yù)熱結(jié)束且系統(tǒng)穩(wěn)定,再對儀器鏡頭的曝光度和焦距進(jìn)行校準(zhǔn),并使用標(biāo)準(zhǔn)比色板對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后將照明模式設(shè)置為頂部照明,拍照模式為單一快照。

2.3.3 樣品顏色測定 取蒲黃樣品粉末(過四號篩)適量,于載玻片上壓制成厚度為1 mm左右的薄片,將載玻片置于儀器白色底板上,變換位置,平行拍照3次,根據(jù)色彩編碼記錄樣品色度空間參數(shù)L、a、b值,并依據(jù)公式Eab=(L2+a2+b2)1/2計算樣品的平均總色度值Eab值。其中L值反映亮度(黑白),a代表紅綠色相(正數(shù)表示偏紅,負(fù)數(shù)表示偏綠),b值代表黃藍(lán)色相(正數(shù)表示偏黃,負(fù)數(shù)表示偏藍(lán))。

2.3.4 建立顏色判別函數(shù) 將樣本數(shù)據(jù)分為生品、輕炭、標(biāo)炭、重炭4組,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行Kruskal-wallisH檢驗,對不同組間顏色差異性進(jìn)行分析,利用判別分析方法建立基于色度空間參數(shù)的數(shù)學(xué)函數(shù)。

2.4 不同炮制程度蒲黃炭含量測定及相關(guān)性分析

2.4.1 不同炮制程度蒲黃炭兩種成分含量測定 取生蒲黃及不同炮制程度蒲黃炭樣品,按照“2.1.1”項制備供試品溶液,按上述“2.1.3”項下色譜條件,記錄色譜峰面積,計算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量。

2.4.2 顏色與有效成分含量相關(guān)性分析 將蒲黃中有效成分香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量與色度值L、a、b、Eab相關(guān)聯(lián),使用SPSS 23.0軟件作相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 蒲黃藥材指紋圖譜分析 測得9批蒲黃藥材指紋圖譜(見圖2),相似度結(jié)果見表1。對照品指紋圖譜見圖3。通過比較各色譜峰的保留時間,確定指紋圖譜中香蒲新苷(10號峰)和異鼠李素-3-O新橙皮苷(12號峰)的位置。其中10號峰色譜響應(yīng)值較高,保留時間適中,故選擇10號峰為參照峰。按照相關(guān)方法進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示,精密度試驗中,17個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.15%,各共有峰相對峰面積的RSD為0.02%～2.54%;穩(wěn)定性試驗中,共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.26%,各共有峰相對峰面積的RSD為0.06%～2.99%;重復(fù)性試驗中,測得各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.17%,各共有峰相對峰面積的RSD為0.03%～1.14%。結(jié)果表明,所建立的指紋圖譜可用于蒲黃的定性分析。

圖2 9批蒲黃藥材(S1—S9)的高效液相色譜指紋圖譜和對照圖譜(R)

注:1.香蒲新苷;2.異鼠李素-3-O-新橙皮苷圖3 對照品的高效液相色譜指紋圖譜

3.2 含量測定 方法學(xué)考察結(jié)果顯示,香蒲新苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 428 923.5x-69 316.3,線性范圍為0.081～5.180 μg(r=0.999 3);異鼠李素-3-O-新橙皮苷回歸方程為y=1 825 126.9x-102 083.4,線性范圍為0.082～5.260 μg(r=0.999 2)。精密度試驗中,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.19%、0.20%(n=6);在穩(wěn)定性試驗中,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.23%、0.27%(n=6);在重復(fù)性試驗中,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量的RSD值分別為2.09%、2.27%,平均回收率分別為101.50%、98.02%,RSD分別為2.07%、1.62%(n=9)。結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確、可行。9批蒲黃藥材含量測定結(jié)果見表2。不同炮制程度蒲黃炭中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測定結(jié)果(見表3)顯示,隨著炮制時間的延長,炭品中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量呈現(xiàn)降低趨勢,綜合外觀、性狀將樣品TPC4和TPC5標(biāo)注為標(biāo)炭,TPC1、TPC2、TPC3為輕炭,TPC6因炮制時間過長,樣品完全炭化,此時香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的色譜峰未檢測到,標(biāo)注為重炭。

表2 9批蒲黃藥材中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測定結(jié)果(n=3)

表3 9批次不同炮制程度蒲黃炭中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測定結(jié)果

3.3 不同炮制程度蒲黃炭顏色值與成分之間的相關(guān)性

3.3.1 不同炮制程度蒲黃炭色度值比較及其判別函數(shù)的建立 9批次不同炮制程度蒲黃炭的L、a、b、Eab值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為50.331、15.342、45.087、53.929,均P<0.05),提示不同炮制程度蒲黃炭的顏色有顯著差異。見表4。

表4 不同炮制程度蒲黃炭色度值比較

將數(shù)據(jù)分為生品、輕炭、標(biāo)炭、重炭4類,以類別為組變量,色度值L、a、b、Eab為自變量,并且作為訓(xùn)練集樣本,采用SPSS 23.0軟件建立以L、a、b、Eab值為輸入變量的判別函數(shù)。再將訓(xùn)練樣本回代[10-11],驗證判別函數(shù)的準(zhǔn)確性良好。

根據(jù)組平均值的同等檢驗結(jié)果可見,L、a、b、Eab值的P值均<0.05,表明在判別函數(shù)中,L、a、b、Eab值均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Wilk’s Lambda檢驗結(jié)果顯示,3個典則判別函數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(λ值分別為0.060、0.564、0.898,均P<0.05)。

3個標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù):

y1=3.149L+1.059a+0.505b-1.728Eab;

y2=10.327L+1.984a+1.257b-9.492Eab;

y3=2.965L-0.318a+0.149b-2.647Eab。

3個未標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù):

y1=0.384L+0.366a+0.069b-0.212Eab-12.429;

y2=1.260L+0.687a+0.172b-1.167Eab-8.005;

y3=0.362L-0.110a+0.020b-0.326Eab+0.279。

根據(jù)典則判別函數(shù)建立的典則判別函數(shù)圖(見圖4),提示不同炮制程度的蒲黃炭顏色差異較明顯,并且在系數(shù)1上呈現(xiàn)一定的規(guī)律。

注:1.生品;2.輕炭;3.標(biāo)炭;4.重炭圖4 4種炮制程度蒲黃炭的典則判別函數(shù)圖

4個Fisher線性判別函數(shù):

F生品=9.840L+12.084a+0.190b-5.801Eab-173.454;

F輕炭=11.015L+12.147a+0.293b-7.202Eab-149.928;

F標(biāo)炭=9.904L+11.161a+0.098b-6.705Eab-108.731;

F重炭=6.637L+8.757a-0.413b-4.082Eab-68.201。

將未知樣本的色度值分別代入4個函數(shù)中進(jìn)行計算,將樣本判入所得函數(shù)值最大的分組中。

3.4 色度值與有效成分含量相關(guān)性分析 香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量與L、a、b、Eab值均不符合正態(tài)分布,故選擇Spearman相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,結(jié)果見表5。從表5可看出,L值與香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈正相關(guān)(P<0.05),表明在一定程度上,L值越小,亮度越低,蒲黃炒炭程度越高,香蒲新苷含量、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量越低。a值與香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量均無相關(guān)性(P>0.05)。b值與香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈正相關(guān)(P<0.05),表明在一定程度上b值越大,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量越高。Eab值與香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05),表明Eab值越大,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量較高。

表5 香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量與L、a、b、Eab值的相關(guān)性

4 討論

蒲黃質(zhì)地疏松,炒制過程中易灰化,其炮制程度難以把握,容易造成“不及”或“太過”,從而影響飲片質(zhì)量。本研究基于9批蒲黃藥材,建立蒲黃藥材的高效液相色譜指紋圖譜,9批蒲黃藥材相似度均大于0.98,表明9批蒲黃藥材與對照圖譜具有較好的一致性,飲片批次間差異較小。并對指標(biāo)性成分香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量進(jìn)行測定。在此基礎(chǔ)上,取9批蒲黃藥材,分別炮制不同程度蒲黃炭,并且通過對不同炮制程度蒲黃炭的色度值進(jìn)行測定和分析,發(fā)現(xiàn)不同炮制程度蒲黃炭的色度值L、a、b、Eab差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,隨著炮制時間的延長,蒲黃炭飲片色度值L、b、Eab均逐漸減小。將不同炮制程度蒲黃炭的色澤與內(nèi)在成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)色度值L、b、Eab值均與香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈顯著正相關(guān),a值與兩種成分含量均無相關(guān)性。以上結(jié)果表明,色度值可作為判斷生蒲黃及蒲黃炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法之一,同時色度值與指標(biāo)性成分之間具有顯著的相關(guān)性。

顏色是傳統(tǒng)中藥炭藥炮制程度最主要的判別依據(jù),色差計將顏色數(shù)字化、精準(zhǔn)化,將這一技術(shù)與中藥中指標(biāo)性成分分析技術(shù)相結(jié)合,建立判別函數(shù)并對成分與色度進(jìn)行相關(guān)性分析,最終形成中藥炭藥炮制適中的識別模式,為中藥炭藥進(jìn)行精確客觀的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。