二參真武湯調控PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制心肌纖維化的體外實驗研究

趙 研,甘芮溪,張小月,程曉昱,葛 嵐,彭代銀,王紅松,陳衛(wèi)東,3,4,5

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院,安徽 合肥 230012; 2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031;3.安徽道地中藥材品質提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012;4.中藥飲片制造新技術與研發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;5.中藥復方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

心肌纖維化是心功能障礙時心臟自身的代償反應,是許多心臟疾病終末期的共同病理生理機制[1]。纖維化的特點是成纖維細胞過度繁殖,導致細胞外基質蛋白沉積增加,雖然輕度的纖維化對心臟起到一定的保護作用,但是過度增殖和沉積會使心臟擴展下降,心臟的舒張活動降低,心肌僵硬,最終導致患者心律失常或心力衰竭[2]。目前,還沒有治療心肌纖維化的最佳治療方案,如果能夠早發(fā)現、早對癥治療,可能會極大提高患者的生命安全。

二參真武湯是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院結合多年臨床用藥經驗[3],基于《傷寒論》真武湯增加紅參、丹參組成的中藥復方。二參真武湯能顯著改善心腎陽虛型慢性心力衰竭患者心功能,降低醛固酮、活性氧、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)水平[4]。二參真武湯也可抑制免疫炎癥反應,抑制心肌細胞凋亡,保護心肌細胞,改善慢性心力衰竭患者心肌纖維化[5]。但是,其治療心肌纖維化的作用機制仍不清楚。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是一種常見的細胞信號通路,參與哺乳動物多種病理生理過程,并參與細胞周期和細胞生長的過程。有研究表明,硫化氫通過調節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路,增加細胞自噬而減輕阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化[6],芪參益氣丸通過PI3K/AKT/mTOR通路激活自噬而減輕心肌纖維化[7],姜辣素通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制細胞凋亡和自噬從而改善心肌纖維化[8]。PI3K/AKT/mTOR信號通路通過調節(jié)細胞的存活、凋亡、生長及心肌收縮甚至相關基因的轉錄等參與調控心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展和病理形成,通過調節(jié)自噬減輕心肌纖維化,在心血管疾病的發(fā)病機制中具有重要的作用?；谏鲜鲈?本實驗將PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白及其mRNA作為心肌纖維化的特異性指標,采用原代心肌成纖維細胞進行實驗研究,以二參真武湯含藥血清進行干預,并以貝那普利作為陽性對照,探究二參真武湯治療心肌纖維化的機制。

1 材料

1.1 試劑 附子、紅參、茯苓、白術、白芍、丹參購于安徽普仁公司,生姜自制,經安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定可用。貝那普利(批號 H200533390):中國成都地奧制藥集團有限公司;膠原蛋白(Collagen,Col)-Ⅰ(批號 ED-30514)、Col-Ⅲ(批號 ED-30513):中國廈門侖昌碩公司;GAPDH(批號 A01020)、山羊抗兔IgG(批號 BS13278)、山羊抗鼠IgG(批號 A21010):美國Abbkin;α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)(批號 ab283851)、PI3K/AKT/mTOR(批號 ab283852):美國Abcam公司;TRIzol(批號 15596-026):美國Invitrogen;SYBR PreMix Ex TaqTMⅡ試劑盒(批號 201):日本Takara;DMEM高糖培養(yǎng)基(批號 11995040):美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 儀器 全波長酶標儀(Multiskan Spectrum):賽默飛公司;高速冷凍離心機(Centrifuge 5810R):上海天美有限公司;倒置光學顯微鏡(DMI6000B):麥克奧迪;超靈敏多功能成像儀(Amersham Image 600):美國GE;qRT-PCR儀(MX3000P):美國安捷倫。

1.3 動物 將大鼠置于溫度(20±2)℃、相對濕度(50±5)%的環(huán)境中飼養(yǎng)1周。本實驗所用動物由河南省鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場[生產許可證號為SCXK(豫)2019-0002]提供。實驗程序按照《實驗動物護理和使用指南》進行,并獲得安徽中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(批文編號:AHUCM-rats-2021032)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 按照文獻[4]制備含藥血清。采用水提回流法提取二參真武湯(丹參30 g,白芍、焦白術、茯苓各10 g,生姜、紅參各6 g,制附子5 g),加入10倍量去離子水,制附子武火先煎0.5 h,文火煎1 h,再加入其他6味藥共煎0.5 h,過濾,濾渣再加8倍量去離子水,煎煮0.5 h,沉降過濾后,將每次煮出的藥液合并,濃縮后備用。

將18只SPF大鼠平均分為3組:空白血清組(生理鹽水10 mL/kg),二參真武湯含藥血清組(二參真武湯15.84 g/kg),貝那普利組(貝那普利0.5 mg/kg),灌胃給藥,每日1次,共7 d,最后1次灌胃后1 h取血,室溫放置30 min后,4 ℃離心,取血清,56 ℃水浴鍋滅菌,過0.45 μm濾頭除菌,備用。

2.2 原代心肌成纖維細胞的提取 按照文獻[9]方法提取原代心肌成纖維細胞。在無菌房內,取出乳鼠心臟剪碎,加入0.1%膠原酶Ⅱ,放置在4 ℃冰箱靜置4 h,取上清鋪板,放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱靜置,等待貼壁,1 h后取出細胞培養(yǎng)皿,顯微鏡下觀察貼壁情況,貼壁細胞即為心臟成纖維細胞,后續(xù)實驗使用2～4代細胞。

2.3 免疫熒光檢測波形蛋白(Vimentin) 將第3次傳代的細胞以每孔1.2×104接種至裝有細胞爬片的6孔板上,用多聚甲醛固定。滴加一抗波形蛋白(Vimentin),4 ℃過夜,取出,在室溫下等待30 min,洗片后二抗孵育3 min,PBS洗片5 min,使用透明指甲油封片,熒光顯微鏡觀察拍照,使用美國國立衛(wèi)生研究院Image J軟件(版本號1.6.0)進行免疫熒光分析,得到抗體陽性面積。

2.4 臺盼藍染色觀察細胞成活率 將原代心肌成纖維細胞消化,制備成2×105的細胞懸液,在9 mL細胞懸液中滴加1 mL 0.4%臺盼藍溶液,在3～5 min內使用顯微鏡觀察計數,帶有藍色的細胞是死細胞,將圖片中死細胞和總細胞進行計數。細胞成活率=(總細胞數量-死細胞數量)/總細胞數量×100%。

2.5 細胞活力檢測 將原代心肌成纖維細胞置于96孔板中(每孔1×104個,100 μL),在標準條件下培養(yǎng)24 h,用CCK-8法檢測細胞活力,根據結果選擇最佳的含藥血清濃度。首先加入含有0、2.5%、5%、10%、15%、20%含藥血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,加入CCK-8試劑,每孔加10 μL,等待反應1 h后在酶標儀450 nm下測定吸光度。用CCK-8法檢測細胞活力,根據細胞活力優(yōu)選復制心肌纖維化模型所使用的AngⅡ濃度和作用時間,加入含有不同濃度(0.1、1、10 μmol/L)的Ang Ⅱ培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細胞12、24、48 h,每孔加10 μL CCK-8試劑,反應1 h后在酶標儀450 nm下測定吸光度。

2.6 分組與給藥 將原代心肌成纖維細胞分為正常組(加入含有10%空白血清的培養(yǎng)基)、模型組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后加入含有10%空白血清的培養(yǎng)基)、二參真武湯組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后加入含有10%二參真武湯含藥血清的培養(yǎng)基)、貝那普利組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后,加入含有10%貝那普利含藥血清的培養(yǎng)基)。

2.7 ELISA檢測Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量 將原代心肌成纖維細胞以1×106/mL的密度接種在6孔板上,加入10%含有不同含藥血清的培養(yǎng)基刺激24 h后,取細胞上清液,根據ELASA試劑盒說明書檢測Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量。

2.8 Western blot法檢測α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平 將原代心肌成纖維細胞以1×106/mL的密度接種在6孔板上,使用1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后分為4組,加入10%含有不同含藥血清的培養(yǎng)基刺激24 h后,配置含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液,提取細胞蛋白,每個培養(yǎng)皿加入1 mL配置好的裂解液,等待30 min后,吸出混合液,離心,取上清,上清液以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液,將混合液體樣品煮沸12 min,蛋白定量以后進行電泳,轉移到硝酸纖維素膜上,放在一抗中過夜,二抗孵育2 h后曝光出現條帶,使用Image J進行蛋白定量。

2.9 qRT-PCR法檢測α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平 將原代心肌成纖維細胞以每毫升1×106個的密度接種于6孔板上,使用1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后分為4組,加入10%含有不同含藥血清的培養(yǎng)基刺激24 h后,在培養(yǎng)皿中加入1 mL Trizol,提取細胞中總RNA,將總RNA逆轉錄成cDNA后,采用Master Mix試劑盒進行檢測。將3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作對照。引物序列見表1。

表1 RT-PCR基因引物信息

3 結果

3.1 原代心肌成纖維細胞的鑒定與模型復制 免疫熒光檢測原代心肌成纖維細胞標志性蛋白Vimentin,結果顯示Vimentin單抗染色陽性大于95%(見圖1)。臺盼藍染色檢測原代心肌成纖維細胞的存活率,根據計數得知細胞存活率在98%以上(見圖2)。分別采用含有0.1、1、10 μmol/L的AngⅡ培養(yǎng)基刺激細胞12、24、48 h,結果顯示1 μmol/L AngⅡ刺激細胞24 h后細胞活力最強(P<0.05)(見圖3)。采用Western blot法檢測纖維化標志物α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達水平(見圖4),結果顯示模型組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h組)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表達水平顯著高于正常組(0 μmol/L AngⅡ刺激24 h組)(P<0.05),說明心肌細胞纖維化模型復制成功。

注:A.被DAPI染色的細胞核;B.被Vi-mentin染色的細胞質;C.同時被DAPI和Vi-mentin染色的細胞核和細胞質圖1 原代心肌成纖維細胞純度(免疫熒光染色,10×20倍)

圖2 原代心肌成纖維細胞成活率(臺盼藍染色,10×20倍)

注:與0 μmol/L AngⅡ組比較,*P<0.05;與1 μmol/L AngⅡ刺激0 h組比較,#P<0.05圖3 不同濃度AngⅡ刺激24 h(A)和1 μmol/L AngⅡ刺激不同時間(B)后原代心肌成纖維蛋白表達水平比較

注:A.正常組(0 μmol/L AngⅡ刺激24 h);B. 模型組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h);與正常組比較,#P<0.05圖4 原代心肌成纖維細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA細胞成活率比較

3.2 二參真武湯含藥血清的最佳濃度 隨著二參真武湯含藥血清濃度升高,原代心肌成纖維細胞活力降低,由于15%和20%二參真武湯含藥血清的抑制作用過強,對原代心肌成纖維細胞的傷害過大,故選擇10%二參真武湯含藥血清進行后續(xù)實驗。見圖5。

注:與不含二參真武湯含藥血清組比較,#P<0.05圖5 不同劑量二參真武湯含藥血清組原代心肌成纖維細胞活力比較

3.3 ELISA法檢測的4組原代心肌成纖維細胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量比較 模型組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量顯著高于正常組(P<0.05),經過10%二參真武湯含藥血清處理后,Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖6 4組原代心肌成纖維細胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量比較

3.4 qRT-PCR檢測的4組原代心肌成纖維細胞中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表達水平比較 模型組α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表達水平顯著高于正常組(P<0.05),經過10%二參真武湯含藥血清處理后,α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA顯著降低(P<0.05)。見圖7。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖7 4組α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA相對表達水平比較

3.5 Western blot檢測的4組原代心肌成纖維細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平比較 模型組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著高于正常組(P<0.05),經過10%二參真武湯含藥血清處理后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖8。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖8 4組原代心肌成纖維細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平比較

3.6 qRT-PCR檢測的4組原代成纖維細胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平比較 模型組PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平均顯著高于正常組(P<0.05);經過10%二參真武湯含藥血清處理后, PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)。見圖9。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖9 4組原代成纖維細胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平比較

4 討論

心肌纖維化的主要特征是細胞外基質蛋白在心肌中過度沉積,導致α-SMA的過度表達和膠原的產生,主要為Col-Ⅰ與Col-Ⅲ比值增加[10]。心肌纖維化可使心肌興奮-收縮耦聯(lián)失調,損害收縮和舒張功能,從而加快心臟疾病的進展,導致心力衰竭[11]。心臟病尤其是心力衰竭患者心肌纖維化嚴重程度與死亡率相關。本研究使用AngⅡ刺激原代心肌成纖維細胞建立細胞模型作為研究對象,結果表明,二參真武湯可以降低心肌纖維化細胞的標志因子α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達水平,產生這種結果的原因可能是二參真武湯可以減少膠原纖維的產生和沉積,抑制心肌成纖維細胞激活,減輕心肌纖維化,二參真武湯可以降低心肌纖維化細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白和mRNA表達,改善心肌纖維化。

二參真武湯的有效成分含有三七皂苷,丹參酮,芍藥苷,人參皂苷Rg1、Re、Rb1[12]。三七皂苷Rg1可以增加細胞自噬,減少細胞增殖,是調控PI3K/AKT/m TOR信號通路實現的[13]。丹參酮ⅡA可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,增強自噬,誘發(fā)自噬性死亡[14]。芍藥苷抑制PI3K/AKT信號通路增加細胞的自噬,減少炎癥因子產生[15]。PI3K/Akt/mTOR通路是細胞對細胞外刺激反應的關鍵細胞級聯(lián),越來越多的證據表明,PI3K/Akt/mTOR通路參與細胞增殖、分化、代謝、細胞骨架重組和凋亡[16-17]。AngⅡ刺激原代心肌成纖維細胞,使PI3K增加,激活AKT,使AKT磷酸化,最后激活mTOR,使原代心肌成纖維細胞代謝和生長改變,增加Col-Ⅰ、Col-Ⅲ沉積,最后導致心肌纖維化。使用二參真武湯含藥血清干預后,PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白和mRNA表達水平均明顯降低。已有研究[18]表明,一些關鍵分子和信號通路可以調節(jié)自噬,其中mTOR可以調節(jié)多種細胞信號通路和過程,如細胞凋亡和自噬。本研究發(fā)現,用二參真武湯處理的模型細胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著降低,心肌纖維化程度減輕,提示二參真武湯通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路增加細胞自噬抑制心肌纖維化。

綜上所述,二參真武湯可能是通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白和基因的表達,增加自噬活性,誘導纖維化細胞自噬性死亡來改善心肌纖維化,對纖維化的原代心肌成纖維細胞起到保護作用。