不同濃度大豆卵磷脂替代蛋黃對東佛里生奶綿羊精液冷凍保存效果的影響

趙 霞,愛倫高娃,馬躍軍,樊 東,烏仁圖亞,娜仁花,吉林臺,*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院;3.赤峰市巴林左旗畜牧工作站;4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué))

提高精液冷凍保存效果是實現(xiàn)高質(zhì)量發(fā)展人工授精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是建立現(xiàn)代畜牧業(yè)遺傳資源庫的重要策略之一。選取優(yōu)質(zhì)凍精資源進行人工授精不僅可以從源頭上減少生殖疾病的傳播,還可以提高優(yōu)秀種質(zhì)資源的改良速度,增加對遺傳特性和生產(chǎn)性能的高效選擇。目前,因綿羊精子易受低溫環(huán)境的影響發(fā)生冷休克現(xiàn)象,我國綿羊精液的冷凍保存技術(shù)尚未取得實質(zhì)性的進展;羊精液的冷凍保存過程中,溫度和滲透壓的改變會嚴重降低精子活力,產(chǎn)生精子膜功能受損、脂質(zhì)過氧化和冷凍保護劑的毒害等現(xiàn)象,降低精子與卵母細胞的結(jié)合能力,因此,優(yōu)化冷凍精液生產(chǎn)工藝對于綿羊精液的長期高效保存具有重要意義。

蛋黃作為冷凍保護劑廣泛用于精液的冷凍保存,可以穩(wěn)定精子頂體膜并在解凍時降低耗氧量。但是,配制冷凍稀釋液時,蛋黃質(zhì)量難以控制,存在病毒感染源和過敏原的風(fēng)險,并且蛋黃中特殊成分能與精清中酶類物質(zhì)相互作用,所產(chǎn)生的物質(zhì)對精子具有毒害作用。通常在稀釋前通過去除部分精清,降低蛋黃的毒害作用,從而提高解凍后的精子質(zhì)量。此外,蛋黃內(nèi)微生物所釋放的內(nèi)毒素會降低精子的受精潛力。

因此,蛋黃作為冷凍保護劑具有潛在的風(fēng)險,從生物安全方面考慮,選擇不含動物源性的冷凍保護劑十分必要。相關(guān)研究表明,大豆卵磷脂(Soybean lecithin,SL)可以替代動物源性冷凍保護劑保存人類、牛和山羊的精液。但截至目前,未見SL在東佛里生奶綿羊精液冷凍保存中使用的報道。本研究旨在評價不同濃度SL在奶綿羊精液冷凍保存中的效果,以添加蛋黃的冷凍精液稀釋液作為對照組,評價不同處理組對精子活率、頂體完整率和妊娠率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物和精液采集 本研究選用來自同一飼養(yǎng)管理條件下的5只優(yōu)秀東佛里生奶種公羊;實驗前40 d,對每只種公羊的日糧添加胡蘿卜和雞蛋,并自由取水;保持每天3～5 km早晚各一次的定時定量運動并使用假陰道法從公羊體內(nèi)收集精液。

1.1.2 試驗藥品 Tris( 三羥甲基氨基甲烷)、果糖、檸檬酸、甘油和大豆卵磷脂(SL)購自Sigma-Aldrich (USA)公司;伊紅、青霉素、鏈霉素購自國內(nèi)。

1.1.3 儀器設(shè)備 電子天平(日本)、生物相差顯微鏡(尼康)、全自動精子分析儀(美國HamiltonThome lvos ll)、0.25 mL麥管(法國)、封口粉(日本);血細胞計、超聲波細胞粉碎儀、pH測試儀、恒溫版、恒溫水浴鍋、細管架、冰箱、剪刀和自制泡沫冷凍箱,以上設(shè)備均來自國內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 稀釋液的配制 Tris基礎(chǔ)稀釋液的配置:所需化學(xué)藥品Tris、果糖、檸檬酸用萬分之一分析天平精準稱量(表1),放入100 mL的燒杯內(nèi),加入50 mL雙蒸水后用玻璃棒進行攪勻,定容至100 mL后倒入三角瓶封口高壓滅菌;冷卻后分別加入青霉素、鏈霉素配制成pH為6.8的基礎(chǔ)稀釋液。

表1 Tris基礎(chǔ)稀釋液配方

Ⅰ號稀釋液的配制(對照組):在Tris基礎(chǔ)液中分別加入18%蛋黃和7%滅菌的甘油,用超聲波儀進行加速溶解和離心,使用細菌過濾器過濾后備用。

Ⅱ-Ⅵ稀釋液的配制(試驗組):在Tris基礎(chǔ)稀釋液中分別加入不同濃度的大豆卵磷脂(0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%)和7%滅菌的甘油(表2),用超聲波儀進行加速溶解和離心,使用細菌過濾器過濾后備用。

表2 不同添加劑稀釋液的配方 %

1.2.2 精液采集和質(zhì)量檢測 使用假陰道法采集精液后,立即將精液放置于34℃恒溫水浴鍋中的試管,靜置10～15 min后觀察精液顏色,檢測精子活率、精子密度和射精量。選擇射精量在0.5～2 mL、精子濃度為1.5～2×109精子/ mL、精子活率大于85%、異常精子率小于10%的精液備用。

1.2.3 精液冷凍處理 為消除個體間差異,將采集的不同公羊的精液混合,分成六等份,分別用Ⅰ-VI號稀釋液進行等溫稀釋,稀釋至最終濃度為4.0×107個精子/ mL,并置于37℃水浴鍋中平衡10 min,平衡后的精液裝入0.25 mL麥管中,并用聚乙烯醇密封。將所有麥管用純棉毛巾或紗布包裹放入4℃冰箱中平衡3 h,再將麥管放置在距離液氮表面3 cm處熏蒸10～12 min,然后收集麥管投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 凍精細管解凍后的質(zhì)量評定 凍精細管在37℃水浴鍋中解凍30s,依照常規(guī)方法檢測解凍后的精子活率、存活時間、死精子率和頂體完整率。根據(jù)Mortimer標準,精子頸部區(qū)域呈現(xiàn)輕微粉紅色或紅色的歸類為活精子。

1.2.5 腹腔鏡輸精 腹腔鏡輸精技術(shù)與同期發(fā)情技術(shù)相結(jié)合進行輸精。上述方法冷凍的精液解凍后借助腹腔內(nèi)窺鏡,采用套管針穿刺方法,將精液直接輸入到發(fā)情后30～36 h母羊的(術(shù)前空腹12 h以上)子宮角,做到“精準輸精”。

1.2.6 母羊管理及妊娠診斷 輸精后的母羊每天補飼優(yōu)質(zhì)干草、青干草、青貯飼料,妊娠后期適量補充精料、微量元素等。輸精后35～40 d使用羊用B超儀檢測妊娠情況,統(tǒng)計妊娠母羊數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件對隨機區(qū)組設(shè)計得到的試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA),進一步用Etukey-Kramer檢驗評估統(tǒng)計學(xué)上的差異,當P<0.05時,差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍稀釋液對精子活率、頂體完整率的影響

精液分別用冷凍稀釋液Ⅰ(對照組)和冷凍稀釋液Ⅱ-Ⅵ(試驗組)稀釋,在4℃冰箱中降溫平衡3 h,用液氮熏蒸冷凍后投入液氮中保存。解凍后檢查其活率和頂體完整率,結(jié)果見表3。

表3 不同稀釋液對精子活率、頂體完整率的影響 %

表3顯示,0.5%、2.5%SL組精子解凍后活率和頂體完整率低于其他組(P<0.05);18%蛋黃和1%、1.5%、2%SL組精子解凍后活率和頂體完整率顯著高于其他各組,且顯著高于0.5%和2.5%組(P<0.05)。

2.2 不同稀釋液對冷凍精液受胎率的影響

表4顯示,添加18%蛋黃和1.0%～1.5%SL冷凍稀釋液稀釋的精液,人工授精后母羊的妊娠率之間無顯著差異(P>0.05)。

表4 不同稀釋液對冷凍精液受胎率的影響 只,%

3 討論

在大多數(shù)動物精液冷凍過程中,蛋黃作為高效的冷凍保護劑而廣泛應(yīng)用。但是,禽類的蛋黃作為精液冷凍保護劑容易受到病原體和細菌的污染,并有可能導(dǎo)致疾病的傳播,而面臨衛(wèi)生安全問題,直接影響精液品質(zhì)。此外,因蛋源不同或蛋源不明會導(dǎo)致無法控制其質(zhì)量。因此,世界各地實驗室在不斷研究可以替代動物源性蛋黃的新型精液冷凍保護劑。而大豆卵磷脂是一種植物源性冷凍保護劑,是高分子量脂蛋白和磷脂的替代品,即可降低動物源性冷凍保護劑的衛(wèi)生風(fēng)險,又能防止稀釋、冷卻和超低溫保存過程中對精子質(zhì)膜的損傷。研究表明,SL用于冷凍牛精液、公羊精液和山羊精液效果顯著。所以,精液冷凍保存過程中,使用非動物源性的冷凍保護劑代替蛋黃是提高羊冷凍精液安全生產(chǎn)效率和冷凍精液受精率的關(guān)鍵所在。

Waterhouse等研究報道表示,大豆卵磷脂在冷凍過程中的保護作用是通過磷脂在降低至冰點過程中減少冰晶的形成而實現(xiàn)。磷脂是蛋黃和大豆卵磷脂磷酸鹽的主要成分,外源磷脂可以取代精子質(zhì)膜的磷脂,維持精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能的正常運行。因此在精子冷凍過程中,這種植物性磷脂能夠有效降低精子質(zhì)膜的氧化受損。本研究結(jié)果顯示,在奶綿羊精液冷凍保存液中添加濃度為1%～2%的大豆卵磷脂,能使精子解凍后的活率、頂體完整率和妊娠率均與蛋黃作為保護劑所得效果無顯著差異,表明SL在奶綿羊精液冷凍過程中對精子起到了保護作用。

另外,本試驗在添加1% 、1.5%SL稀釋液稀釋奶綿羊精液時發(fā)現(xiàn),SL對精子的運動速度有明顯的促進作用,這可能與蛋黃稀釋液黏度高于SL稀釋液有關(guān),高黏度環(huán)境會阻礙精子的運動速度。但是,高濃度的SL對精子活力和存活能力有一定的毒性作用。稀釋液中加入高濃度的SL會增加稀釋液的黏度,而稀釋液中的雜物也會降低精子的受精能力,這可能與稀釋液的滲透壓有關(guān)。稀釋液中滲透壓隨著SL濃度的增加而降低,導(dǎo)致精子發(fā)生損傷現(xiàn)象。

由于較高濃度的SL可能存在對精子的毒害作用,而較低濃度可能不足以保護精子,所以稀釋液中的大豆卵磷脂含量存在一個臨界值。這與本試驗結(jié)果相一致,當SL添加濃度為1%～2%時,公羊精液解凍后精子活率和頂體完整率較高,而SL添加濃度為0.5%和2.5%時,精子活率和頂體完整率下降。所以,在東佛里生奶綿羊精液冷凍保存稀釋液中大豆卵磷脂最佳濃度為1%～2%。且Khalifa等報道,添加大豆卵磷脂的冷凍精液在輸精后獲得了較理想的受胎率,與蛋黃凍精受胎率無顯著差異。

綜上所述,大豆卵磷脂可以取代蛋黃作為精液冷凍保護劑,并在精液冷凍-解凍過程中對精子發(fā)揮保護作用,其最佳添加濃度為1%～2%。這為商業(yè)化、標準化地生產(chǎn)綿羊冷凍精液奠定基礎(chǔ),提高綿羊凍精的冷凍效果,促進羊凍精供種的進程。