酶聯免疫吸附試驗檢測狂犬病抗體的實際應用探討

李 繁,吳寒光, 段新華, 施遠國, 羅國強, 陳雨晴, 李穎鑫

(深圳市動物疫病預防控制中心, 廣東 深圳 518052)

狂犬病是由彈狀病毒科的狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患傳染病,主要在野生動物(狼、狐貍、鼬鼠、蝙蝠等)及家養(yǎng)動物(狗、貓、牛等)中流行傳播。人狂犬病主要被患病動物咬傷所致,或與密切接觸有關,感染發(fā)病后進展速度快,病死率高達100%。動物接種狂犬病疫苗是預防人狂犬病最有效的手段,因此加強犬、貓的狂犬病免疫工作具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

動物接種疫苗后,科學評價免疫效果有賴于準確檢測和監(jiān)測血清中狂犬病免疫抗體水平,現有的檢測方法有多種,如熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)、快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)、小鼠病毒中和試驗(MNT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等,前三種方法特異性強、準確性好,但都需要活病毒,試驗時間長,對實驗室生物安全條件和儀器設備配置要求高,不適合在基層檢測中推廣應用。而ELISA檢測操作簡便快捷,成本也不高,近年來已有商品化的試劑盒應用于狂犬病免疫抗體的監(jiān)測,以評估免疫效果。本研究以FAVN法為標準,對ELISA檢測的符合率、特異性、靈敏度、假陽性、假陰性、OD值區(qū)間分布等參數進行全面分析,探討ELISA方法的應用價值,為基層檢測業(yè)務的開展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒 狂犬病毒抗體ELISA檢測試劑盒,批號:RV20211008E,由國內某生物藥業(yè)有限公司生產。

1.1.2 儀器 洗板機:BIOTEX ELX808,酶標儀:BIOTEX ELX50,精密移液器:Eppendorf。

1.1.3 檢測樣品 犬血清。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 犬只來自深圳市10個行政區(qū),隨機采樣,無菌采血3mL,凝固后分離血清于離心管中,一式兩份,-20℃保存待檢。

1.2.2 中和試驗 委托軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所OIE狂犬病參考實驗室檢測,檢測方法為熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)。中和效價≥0.5 IU/mL,判樣品陽性,表示該份血清的來源動物具備狂犬病免疫保護能力,中和效價<0.5 IU/mL,判樣品陰性,表示該份血清的來源動物無狂犬病免疫保護能力。

1.2.3 ELISA檢測 嚴格按試劑盒使用說明書進行樣品稀釋、加樣、孵育、洗板、顯色、終止反應、讀板等操作。以酶標儀雙波長450nm和630nm讀取OD值,并計算A值和S/CO值:A值=OD450nm- OD630nm,S/CO值=樣品A值/臨界對照A值。當S/CO值≥1.0,判樣品陽性;S/CO值<1.0,判樣品陰性。

1.2.4 數據分析處理 采用SPSS軟件對檢測結果分析處理,進行一致性檢驗,計算Kappa值,評估ELISA與FAVN的檢測結果一致性,并對陽性符合率、陰性符合率、總符合率、特異性、靈敏度、OD值與抗體水平的關聯性和分布等進行計算分析。

2 結果與數據統(tǒng)計

2.1 樣品定性檢測結果

結果見表1,共檢測了來自深圳市10個行政區(qū)的290份犬血清,FAVN法檢測為陽性樣品260份、陰性樣品30份,ELISA法檢測為陽性樣品228份、陰性樣品62份。

上表數據,經采用SPSS軟件進行診斷結果一致性檢驗,Kappa值為0.545。

260份FAVN法陽性樣品中,ELISA法檢測為226份陽性,陽性符合率為86.92%;30份FAVN法陰性樣品中,ELISA法檢測為28份陰性,陰性符合率為93.33%;總符合率為87.59%(254/290)

2.2 不同中和效價的樣品檢測結果

FAVN法中和效價≥0.5 IU/mL,判樣品陽性,中和效價<0.5 IU/mL,判樣品陰性。將陰性樣品分類設2個中和效價區(qū)間,陽性樣品設10個中和效價區(qū)間,分別對ELISA法檢測結果的符合率進行了分區(qū)間計算,結果見表2和圖1。符合率最高為100%,最低為55.88%。

圖1 不同中和效價的樣品ELISA法檢測結果符合率

表2 不同中和效價的樣品ELISA法檢測結果

2.3 相同中和效價的樣品檢測結果

選取表2中ELISA法與FAVN法檢測結果一致的樣品,分析同一中和效價的不同樣品的OD值大小分布區(qū)間?？紤]統(tǒng)計數量的要求,選擇了同一中和效價的樣品數量≥20份者,其中4.5 IU/mL樣品34份,13.5 IU/mL樣品55份,40.5 IU/mL樣品55份。以上144份樣品OD值經計算S/CO值最高為7.3。S/CO值分區(qū)間統(tǒng)計結果見表3和圖2～圖4。

圖3 中和效價13.5IU/mL的樣品ELISA檢測S/CO值分布圖

圖4 中和效價40.5IU/mL的樣品ELISA檢測S/CO值分布圖

表3 相同中和效價的樣品ELISA檢測S/CO值區(qū)間分布

表3數據和圖2～圖4分布圖顯示,中和效價4.5 IU/mL和13.5 IU/mL的樣品無S/CO值≥6.0的檢測值,其它各S/CO值區(qū)間均有分布。中和效價4.5 IU/mL的樣品S/CO值在1.0～1.9區(qū)間的百分率最高(47.06%),中和效價13.5 IU/mL的樣品S/CO值在4.0～4.9區(qū)間的百分率最高(30.91%);中和效價40.5 IU/mL的樣品S/CO值在2.0～2.9區(qū)間的百分率最高(27.27%),4.0～4.9區(qū)間的百分率為25.45%。

3 討論

3.1 免疫保護屏障

當犬群免疫覆蓋率達到70%以上時,即可有效抑制狂犬病的傳播 。熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)是國際獸醫(yī)局(OIE)推薦用于檢測動物血清狂犬病抗體活性的方法。本次研究檢測樣品來自深圳10個行政區(qū),FAVN法檢測免疫保護合格率達89.66%;經初步分析犬只免疫史,發(fā)現成年和經多次免疫的犬血清中和效價水平都較高,而幼年犬、僅初免或未按要求加強免疫的,則中和效價水平較低或不合格。深圳市2006年頒布《深圳市養(yǎng)犬管理條例》,實行狂犬病免費強制免疫制度,市政府將每年的4月和9月定為犬類狂犬病強制免疫行動月,不斷提高免疫率,并將狂犬病疫苗經費納入財政預算,統(tǒng)一采購進口狂犬病滅活疫苗,以提高免疫質量。經多年的免疫效果監(jiān)測發(fā)現,深圳市的犬類狂犬病免疫抗體合格率一直保持在較高水平,建立了良好的免疫保護屏障。

3.2 定性檢測

Kappa檢驗常用于評價待驗證的診斷實驗方法與金標準的一致性,Kappa取值0～1之間,Kappa≥0.75,說明兩種方法診斷結果一致性較好; 0.4≤Kappa<0.75,說明兩種方法診斷結果一致性一般; Kappa<0.4,說明兩種方法診斷結果一致性較差。本研究數據經采用SPSS軟件對FAVN法和ELISA方法進行診斷結果一致性檢驗,Kappa值為0.545,表明該ELISA檢測試劑盒的結果為中度一致。王培等曾比較6種國產和進口的不同品牌的商品化試劑盒,Kappa值由高至低依次為:0.583、0.549、0.465、0.370、0.184、0.105,前兩種均為進口試劑盒,本次試驗所用試劑盒Kappa值為0.545,說明檢測效能與進口產品相近。

陽性符合率通常用于評估檢測的靈敏度,而陰性符合率是檢測特異性的重要指標,本次試驗所用ELISA試劑盒的陽性符合率為86.92%;陰性符合率為93.33%;總符合率為87.59%。說明特異性強,出現假陽性的概率較小,相比較則陽性符合率略低,說明產品的靈敏度有待提高,檢測時出現假陰性的概率會大于出現假陽性的概率,在基層應用ELISA法檢測時,對檢測結果分析時應予注意。

從不同中和效價的樣品檢測結果可以看出,中和效價0.00～0.20 IU/mL和中和效價≥15.01的樣品符合率均為100%,說明這些中和效價區(qū)間的樣品ELISA法檢測時不會出現假陽性和假陰性。符合率最低的為中和效價0.51～ 2.00 IU/mL的樣品,符合率僅為55.88%;其次為中和效價0.5 IU/mL的樣品,符合率為62.5%;說明這兩個中和效價區(qū)間的樣品,ELISA法檢測時容易出現假陰性的結果。隨著中和抗體效價的升高,符合率也逐步提高,這提示在作免疫效果評價時,若為初次免疫,且接種后時間不長的犬只,建議對ELISA法檢測的陰性結果進一步進行驗證。

動物免疫應答產生的抗體水平為包含中和抗體在內的所有抗體的總和,其特異性結合位點既有狂犬病毒顆粒內部的結構蛋白或酶,也有病毒外部蛋白表位如糖蛋白等, 因此血清抗體水平始終不能代表保護性中和抗體的水平,這也是ELISA法與FAVN法檢測結果有差異的根本原因。不同品牌廠家的產品,由于生產工藝和技術不同,其酶標板上包被不同的抗原或者不同的單抗或多抗,純度也有差異,此外疫苗種類和來源不同,其免疫應答抗體的組成和水平也會有差異,因此ELISA法檢測結果的可靠性受多種因素的影響,建議各地應通過采集當地犬只血清進行試劑盒比對試驗,選擇特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好的產品用于免疫抗體水平監(jiān)測的初步篩查。

3.3 定量檢測

本次試驗中和效價4.5 IU/mL和13.5 IU/mL的樣品無S/CO值≥6.0的檢測值,47.06%中和效價4.5 IU/mL的樣品其S/CO值區(qū)間為1.0～1.9;而中和效價為40.5 IU/mL的樣品則有9%的檢測值為S/CO值≥6.0。但更需要注意的是,在ELISA法檢測S/CO值(1.0～5.9)由低至高的各個區(qū)間中,相同區(qū)間內各個中和效價的陽性樣品均有分布,也就是說中和效價與S/CO值兩者之間并不存在一一對應的線性關系,高中和效價的樣品其S/CO值可能也會小于低中和效價的樣品,反之,低中和效價的樣品其S/CO值可能也會高于高中和效價的樣品。因此利用ELISA法作為檢測狂犬病免疫保護抗體水平的定量檢測方法,其有效性難以確認。

于鵬程等通過檢測60份免疫后的人血清,認為ELISA法可用于定量檢測0.5～10 IU/mL的有效線性范圍的血清樣本,與本次研究的結果有異,可能與所用試劑盒不同有關,而且人和動物的血清樣本、以及免疫疫苗和抗體結構等均有差異。袁潔等在對廣州地區(qū)家養(yǎng)犬只開展免疫抗體水平監(jiān)測中也發(fā)現ELISA在測定具體的抗體滴度方面與FAVN仍有較大誤差。我們認為,在檢測動物血清樣本時,與FAVN法的金標準比較,ELISA方法的定性效能尚存在諸多差異,若用于定量檢測,需要做更廣泛深入的研究。