新版國家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》血凝和血凝抑制試驗(yàn)的理解與操作實(shí)踐

陳文華,邱 冬 ,呂宗德,黃思彬,李鳳玲,陳昌海,*

(1.應(yīng)節(jié)(南京)智能科技有限公司,江蘇 南京 210012;2. 江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心;3.南京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)

新城疫(Newcastle disease,ND)是嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的禽病之一,為此世界動(dòng)物組織(OIE)將其列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為二類動(dòng)物疫病。血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)是診斷和檢測ND最重要的方法之一,也是國際貿(mào)易檢疫中規(guī)定使用的方法,我國對ND實(shí)施全面免疫,并要求開展免疫效果評(píng)估,也是采用該標(biāo)準(zhǔn)中的HA、HI試驗(yàn),因而具有廣泛的應(yīng)用。2020年12月14日國家市場監(jiān)督管理總局和國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)聯(lián)合發(fā)布了新版《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2020)。

其中對HA和HI試驗(yàn)增加了4HAU抗原配制的標(biāo)定,對靜置時(shí)間和結(jié)果判定進(jìn)行了修改。為使廣大從業(yè)人員更好地理解和掌握新版標(biāo)準(zhǔn),作者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢測操作實(shí)例,就4HAU抗原標(biāo)定,靜置時(shí)間及結(jié)果判定等幾個(gè)方面進(jìn)行分述,以期為準(zhǔn)確理解新版標(biāo)準(zhǔn),提高試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原 生產(chǎn)日期:2021.05.06,生產(chǎn)批號(hào):10132101,有效期至:2023.05.05;雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)陽性血清 生產(chǎn)日期:2021.06.10,生產(chǎn)批號(hào):10152102,有效期至:2023.06.09;SPF雞陰性血清 生產(chǎn)日期:2021.04.25,生產(chǎn)批號(hào):10142101,有效期至:2023.04.24,以上均購自青鳥立見診斷技術(shù)發(fā)展中心。3.8%枸櫞酸鈉溶液(自配)。0.01mol/L pH 7.2 PBS(自配)。1%雞紅細(xì)胞懸液(RBC)(自配)。

1.2 主要儀器

微量移液器;微型搖蕩器;96孔V型血凝板。

1.3 雞血清樣品

來自13個(gè)養(yǎng)殖場(戶)委托檢驗(yàn)樣品,每場60份,共計(jì)780份。

1.4 方法

按照《新城疫診斷技術(shù)》(GB/T16550-2020)所述方法檢測。免疫效果評(píng)價(jià),按《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于印發(fā)國家動(dòng)物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃(2021-2025)的通知》規(guī)定,HI效價(jià)≥25,判為個(gè)體免疫合格。個(gè)體免疫抗體合格數(shù)量占免疫群體總數(shù)不低于70%的,判定為群體免疫合格。

1.4.1 HA試驗(yàn)及4HAU抗原標(biāo)定 本次測定HA效價(jià)為1∶256,配制4HAU抗原液,4HAU抗原標(biāo)定具體操作如下:

本次所測抗原效價(jià)為8log2(1∶256),則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1∶64(256除以4),稀釋時(shí),將1 mL抗原加入63 mL PBS中即為4HAU抗原。配制時(shí)要根據(jù)實(shí)際用量,如做標(biāo)定用,抗原液1～2 mL就夠用。(如本次配制抗原液1.2 8mL,取0.02 mL抗原,加入1.26 mLPBS)。

第一步:在96孔V型板第一排第1孔、第2孔、第3孔、第4孔、第5孔、第6孔分別加入25 μL,25 μL*2,25 μL*3,25 μL*4,25 μL*5,25 μL*6 PBS液。

第二步:每孔分別加入4HAU(1∶64倍稀釋)25 μL,同時(shí)吹打3～5次,充分混勻。

第三步:分別將第一排相應(yīng)孔中的液體分別取25 μL置第二排相對應(yīng)的孔中,此時(shí)第二排第1～6孔抗原液稀釋度依次為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7。

第四步:再在第1～6孔每孔加入25 μLPBS液,第7孔加入50 μLPBS。

第五步:再在每孔加入1%RBC 25 μL。室溫靜置20～30 min,觀察結(jié)果。

結(jié)果判定同HA試驗(yàn)。本次是第二孔完全凝集(1∶3),則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1∶48,即將原抗原按1∶48倍稀釋為HI試驗(yàn)工作液。

1.4.2 HI試驗(yàn) 將樣品、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清分別在96孔V型板上倍比稀釋,加入標(biāo)定好的4 HAU抗原后,振蕩15 s,室溫靜置至少20 min。加入1%RBC,振蕩混勻后,室溫靜置20 min～40 min,對照孔呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

13個(gè)養(yǎng)殖場個(gè)體免疫抗體合格率,群體抗體幾何平均滴度(GMT),群體免疫抗體變異系數(shù)見表1。由表1可知,13個(gè)養(yǎng)殖場個(gè)體免疫抗體合格率均達(dá)到國家規(guī)定70.00%的標(biāo)準(zhǔn),其中有2個(gè)場個(gè)體免疫抗體合格率達(dá)100.00%,10個(gè)場個(gè)體免疫抗體合格率均為90.00%以上,說明這些場的新城疫免疫效果優(yōu)良,有一個(gè)場個(gè)體免疫抗體合格率為80.00%,經(jīng)查該場所采樣雞群為初免后28日齡雛雞,尚未加強(qiáng)免疫。

從13個(gè)群體免疫抗體幾何平均滴度看,有4個(gè)禽場達(dá)到9以上,有8個(gè)場達(dá)到了8以上,表明群體免疫抗體水平非常高,僅個(gè)體免疫抗體合格率為80.00%的場,其免疫抗體幾何平均滴度為6.09,這再次提示該雞群要加強(qiáng)免疫。

對同一個(gè)場采集的60份樣品抗體滴度進(jìn)行變異系數(shù)計(jì)算,可以看出,有12個(gè)禽群變異系數(shù)小于0.3,進(jìn)一步說明這些群體免疫抗體整齊度非常高,同樣個(gè)體免疫抗體合格率為80.00%的禽群變異系數(shù)為0.89,說明群體免疫抗體整齊度較低,需要加強(qiáng)免疫,提高群體免疫抗體整齊度。

表1 13個(gè)雞場免疫抗體合格率、GMT、CV情況表

2.2 HA試驗(yàn)結(jié)果判定時(shí)間

新版標(biāo)準(zhǔn)HA試驗(yàn)振蕩混勻后室溫靜置20 min～30 min或2℃～8℃靜置60 min,而原版標(biāo)準(zhǔn)是室溫20℃～25℃下靜置40 min后或4℃靜置60 min,相比較我們在實(shí)際檢測中認(rèn)為新版標(biāo)準(zhǔn)更準(zhǔn)確。

2.3 HAU抗原標(biāo)定

舊版標(biāo)準(zhǔn)沒有關(guān)于4HAU抗原標(biāo)定,過去我們做試驗(yàn)要求做4HAU抗原回滴,將配置好的4HAU抗原做1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等4個(gè)稀釋度稀釋,當(dāng)稀釋度在1:4時(shí)定全凝集,認(rèn)為4HAU抗原配制準(zhǔn)確,如果不是1∶4定全凝集,往往憑經(jīng)驗(yàn)酌情增加或減少抗原量,從而缺乏科學(xué)性。新版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了4HAU抗原標(biāo)定方法,“即將4HAU進(jìn)行系列稀釋,使最終稀釋度分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7,然后按照HA試驗(yàn)。如果配制的抗原液為4 HAU,則1∶4稀釋度將給出凝集終點(diǎn),如果4 HAU高于4個(gè)單位,可能1∶5或1∶6為終點(diǎn);如果較低,可能1∶2或1∶3為終點(diǎn)。應(yīng)根據(jù)檢測結(jié)果將抗原稀釋度做適當(dāng)調(diào)整,使工作液確為4 HAU。為便于大家理解,盡管新版國標(biāo)給出了4 HAU抗原配置和標(biāo)定方法。但對一些實(shí)驗(yàn)室特別是初次接觸試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室操作人員來說比較抽象,難以理解。為此筆者所在實(shí)驗(yàn)室相關(guān)人員對該試驗(yàn)進(jìn)行了實(shí)際操作分析,并對操作過程進(jìn)行了細(xì)化。

2.4 HI試驗(yàn)

新版標(biāo)準(zhǔn)在加入4 HAU抗原后,振蕩15 s,室溫靜置至少20 min或2℃～8℃至少60 min;舊版標(biāo)準(zhǔn)室溫下(約20℃～25℃)靜置不少于30 min,4℃不少于60 min。新版時(shí)間減少了10 min,而且2℃～8℃設(shè)定范圍比單純4℃符合實(shí)際。舊版中使用的“輕叩”“輕晃”等字樣都被新版中“振蕩”所代替,符合大規(guī)模檢測時(shí)的實(shí)際情況。

2.5 HI結(jié)果判定

新版標(biāo)準(zhǔn)給出了血清HI效價(jià)為陰性或陽性的判定標(biāo)準(zhǔn),而舊版標(biāo)準(zhǔn)僅僅是給出了判定是否是新城疫病毒的標(biāo)準(zhǔn),新版標(biāo)準(zhǔn)更符合實(shí)際應(yīng)用。

3 討論

HA和HI試驗(yàn)是ND等重要疫病診斷、監(jiān)測、檢測時(shí)所使用的最經(jīng)典方法,也是OIE等推薦國際貿(mào)易中所使用的經(jīng)典方法,具有廣泛的使用領(lǐng)域。整個(gè)試驗(yàn)過程難度不大,不需要使用高檔儀器設(shè)備,尤其適用于基層單位及養(yǎng)殖場(戶)使用,但由于操作步驟較多,如果操作不規(guī)范、不熟練等,最終會(huì)影響整體試驗(yàn)結(jié)果。

HI試驗(yàn)中,4 HAU抗原配制和標(biāo)定是該試驗(yàn)?zāi)芊癯闪⒌年P(guān)鍵所在,新版標(biāo)準(zhǔn)中增加了對4 HAU抗原進(jìn)行標(biāo)定,這提高了抗原配置的精確性,從而確保了最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文對新版標(biāo)準(zhǔn)中4 HAU抗原配置和標(biāo)定進(jìn)行了細(xì)化操作,使得整個(gè)操作過程更為簡單易懂,便于實(shí)驗(yàn)人員理解掌握。

為使HA、HI試驗(yàn)結(jié)果判定更清晰,建議在HA結(jié)果判定時(shí),在實(shí)驗(yàn)桌上放一張白色A4紙,并將血凝板傾斜(小于60°)從正面讀結(jié)果;HI試驗(yàn)讀板時(shí),對準(zhǔn)光源,將A4紙放在血凝板上約4～5 cm距離從背面讀結(jié)果,這樣判讀結(jié)果更清晰。

新版與舊版標(biāo)準(zhǔn)相比,少了新城疫病毒鑒定判定標(biāo)準(zhǔn)。建議改版時(shí),增加“用于檢測抗體時(shí),HI效價(jià)≤30 log2, 判為HI陰性; HI效價(jià)≥4 log2判為HI試驗(yàn)陽性。用于檢測抗原(病原)時(shí),抗原液(病毒液)HA效價(jià)≥4 log2,且標(biāo)準(zhǔn)新城疫陽性血清對其HI效價(jià)≥4 log2,判為新城疫病毒。這樣就更能體現(xiàn)HA/HI試驗(yàn)既能用于抗體檢測,又能用于抗原(病原)鑒定。

新版標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施,使得新城疫HA、HI試驗(yàn)在操作上更精準(zhǔn)詳細(xì),在結(jié)果判定上更科學(xué)準(zhǔn)確,體現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)的引領(lǐng)性、規(guī)范性和指導(dǎo)性。它使試驗(yàn)人員更加有標(biāo)準(zhǔn)可依,有步驟可循,提高了試驗(yàn)操作的規(guī)范性和精準(zhǔn)性,同時(shí)也為進(jìn)一步指導(dǎo)ND防控提供了技術(shù)支撐與標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。