綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測方法的特異性試驗

豆 玲,周 峰,★,高軍軍,王雪瑩,王志宇,康文彪,*

(1.甘肅省動物疫病預防控制中心,甘肅 蘭州 730046;2.英科新創(chuàng)(蘇州)生物科技有限公司)

根據快速準確診斷綿羊痘/山羊痘的實際需求,我們成功建立了綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測方法,為了保證該方法在應用中的準確性和可靠性,我們選用臨床癥狀與綿羊痘/山羊痘相似疫病的病原(口蹄疫病毒、傳染性膿皰皮炎病毒)、其他痘病毒(雞痘病毒)、綿羊痘病毒、羊痘疫苗和羊痘重組質粒樣本進行了該RPA檢測方法特異性試驗研究。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

1份羊痘疫苗、3份羊痘病毒核酸陽性樣本(RPO35基因片段克隆至載體pUC57后制作的重組質粒)、2份口蹄疫病毒核酸陽性樣本(疫苗)、2份羊傳染性膿皰皮炎病毒核酸陽性樣本(疫苗)、2份雞痘病毒陽性樣本(疫苗)、1份陽性對照、2份陰性對照。

1.2 主要試劑和儀器

核酸(DNA/RNA)提取試劑盒購自哈爾濱元亨公司。RPA試劑盒(Twist Basic及Twist nfo)購自英國Twist Dx公司。HybriDetect 1試紙條購自Milenia公司。國產RPA試劑購自先達公司。國產試紙條購自英科新創(chuàng)公司。恒溫水浴鍋購自Heal force公司。高速離心機購自Eppendorf公司。

1.3 核酸提取

DNA和RNA的提取按照周峰等文獻中的方法進行提取,保存。

1.4 RPA擴增

按照表1配制Rehydration Solution溶液。

表1 Rehydration Solution溶液組分

表2 引物序列

在試劑盒準備的8聯管中配制Rehydration Solution溶液完成后,總體積為46.5 μL,混勻復溶。將2.5 μL醋酸鎂與1 μL模板混合均勻后,加入8聯管中,隨后將8聯管放入水浴鍋中,37℃反應15min。反應結束后,取5 μL反應產物至1.5 mL離心管中,用稀釋液20倍稀釋,混勻后,將試紙條插入離心管中,等待15 min后查看反應結果。反應體系最終鎂離子濃度為21 mmol/L。

2 結果

特異性試驗結果如圖1所示。從圖1可以看出,建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測方法的特異性良好,對羊痘疫苗、羊痘重組質粒、綿羊痘病毒核酸和山羊痘病毒核酸陽性樣品能夠在試紙條上顯示出陽性條帶,口蹄疫病毒、傳染性膿皰皮炎病毒和雞痘病毒均無陽性條帶出現。

圖1 特異性試驗結果

3 討論

綿羊痘/山羊痘是由綿羊痘/山羊痘病毒引起的動物傳染病,以綿羊和山羊的體溫升高、全身性丘疹或結節(jié)、水皰、內臟病變?yōu)樘卣?特別是肺部具有明顯的病變特征。其病原綿羊痘病毒/山羊痘病毒的分子生物學檢測方法常用的有普通 PCR和熒光定量 PCR,RPA替代PCR檢測技術主要優(yōu)勢在于不需要特定昂貴的溫控儀器即可快速定量擴增目的DNA或RNA病毒,該方法克服了對傳統(tǒng)PCR檢測設備的依賴,在臨床和現場操作中簡單、快捷、實用性強。在成功建立綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測方法的基礎上,本文對改進方法檢測的特異性進行了研究,從試驗結果看,我們建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測方法對綿羊痘/山羊痘病毒的檢測具有很好的特異性。

4 結論

本研究對我們建立的綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用RPA檢測方法的特異性開展了試驗研究,結果表明,該方法對綿羊痘和山羊痘病毒核酸的檢測具有很好的特異性,在綿羊痘/山羊痘病毒的臨床檢測上應用前景廣闊。