姜曉陽(yáng),馮艷茹,劉亞華,侯彥深 (. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)中心,新疆 烏魯木齊 8300;. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,新疆 烏魯木齊 8300)
疼痛是臨床最難控制、卻又最常見(jiàn)的癥狀之一,是許多疾?。ㄈ绨┌Y、燒傷、炎癥等)的伴隨癥狀之一[1]。目前,比較公認(rèn)的疼痛定義為由明確組織損傷或潛在組織損傷引發(fā)的機(jī)體不愉快的情緒體驗(yàn),可伴隨機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的生理變化[2]。臨床治療或緩解疼痛的首選方案為世界衛(wèi)生組織推薦的“三階梯”止痛原則,但隨著藥物療程的延長(zhǎng)和給藥劑量的增加,患者會(huì)出現(xiàn)耐藥、成癮等副作用,使其疼痛癥狀遷延反復(fù),無(wú)法達(dá)到預(yù)期的療效[3]。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gan?glia,DRG)是脊髓疼痛信號(hào)傳入的第一級(jí)神經(jīng)元,是痛覺(jué)向中樞傳導(dǎo)的紐帶,在疼痛信號(hào)的產(chǎn)生機(jī)制中至關(guān)重要[4]。一項(xiàng)針對(duì)先天性無(wú)痛癥患者的研究發(fā)現(xiàn),患者基因測(cè)序結(jié)果中可見(jiàn)明顯的SCN9A基因突變,說(shuō)明SCN9A基因與疼痛的發(fā)生密切相關(guān)[5]。Nav1.7由基因SCN9A編碼,主要在外周感覺(jué)神經(jīng)元(如DRG)中表達(dá),與疼痛發(fā)生密切相關(guān)[6]。從基因角度探究疼痛的治療,已成為臨床疼痛治療的新方向。本研究基于建立的慢性炎性疼痛大鼠模型,探究鞘內(nèi)注射shRNA慢病毒載體對(duì)模型大鼠疼痛行為學(xué)及脊髓膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、OX42蛋白表達(dá)的影響,以期為臨床慢性炎性疼痛的基因治療提供參考。
SPF級(jí)雄性SD大鼠54只,體質(zhì)量(200±10)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(新)2018-0003。大鼠分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、水。飼養(yǎng)環(huán)境:12 h晝夜交替,室溫22~24 ℃,相對(duì)濕度40%~70%。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(G-201512)。
慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司,七氟烷購(gòu)自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司,完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)購(gòu)自賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司,TRIzol購(gòu)自Thermo Scientific,SYB?RGreen PCR試劑盒、cDNA試劑盒購(gòu)自Biosystems,增強(qiáng)型RIPA裂解液購(gòu)自博士德生物工程有限公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
熱刺痛儀(PL-200)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司,機(jī)械痛測(cè)量?jī)x(Electric Von Frey)購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司,微量注射器(25 μL)購(gòu)自上海安亭微量進(jìn)樣器廠,GYQ型便攜式氧氣筒購(gòu)自冀州市佳光醫(yī)療器械有限公司,-80 ℃冰箱、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(1510)購(gòu)自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司。
將54只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、空病毒組、慢病毒載體組,每組18只。正常組大鼠注射0.1 mL生理鹽水??詹《窘M、慢病毒載體組采用七氟烷麻醉大鼠,建立慢性炎性疼痛模型[7]:大鼠右后足底消毒后注射0.1 mL CFA。大鼠右后足腫脹,不能觸及地面,表明慢性炎性疼痛模型建立成功。
參考文獻(xiàn)[8],大鼠麻醉后取俯臥位,備皮、消毒,在L3、L4皮膚行正中切口至皮下筋膜,鈍性分離L3、L4棘突附近的背脊肌、筋膜和韌帶,充分暴露L3、L4棘突間隙。然后用彎針從L3椎體棘突處輕輕挑破黃韌帶及硬脊膜,沿黃韌帶開口處置入PE-10導(dǎo)管,將導(dǎo)管縫扎在黃韌帶上,并將導(dǎo)管的外口引出至大鼠頸背部,逐層縫合,最后用熱處理的止血鉗夾閉導(dǎo)管外口。
設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠Nav1.7的shRNA并委托上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成,構(gòu)建慢病毒載體LV-SCN9ARNAi,保存于-80 ℃冰箱中。從冰箱取出病毒液,在37 ℃輕輕晃動(dòng)溶解,將病毒液滴度調(diào)整至1×109TU/mL后置于冰盒上,用于鞘內(nèi)注射。各組大鼠在疼痛模型建立完成當(dāng)天進(jìn)行鞘內(nèi)注射,正常組鞘內(nèi)注射PBS 10 μL,空病毒組和慢病毒載體組分別鞘內(nèi)注射空病毒和慢病毒液10 μL。
分別在建模前1 d及建模后第1、3、6、9、13天使用Electric von Frey機(jī)械痛測(cè)量?jī)x及PL-200熱刺痛儀測(cè)定PMWT和PTWL。
參考文獻(xiàn)[20],于建模后第3、6、13天每組各處死6只大鼠并完成脊髓及DRG取材:10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,鈍性分離腿部肌肉,游離坐骨神經(jīng),沿坐骨神經(jīng)向上追蹤至脊椎的椎間孔即可見(jiàn)L4、L5DRG;再沿L4、L5各自神經(jīng)走行方向?qū)RG從椎間孔輕柔抽出,并留取L4~L5脊髓節(jié)段組織;用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液清洗,分裝后,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
取凍存的大鼠組織,提取組織總蛋白后,按照BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。Western blot檢測(cè)大鼠DRG中Nav1.7和脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)水平。用眼科剪將組織剪成0.1~0.2 g,置于EP管中,加入1 mL RIPA裂解液(80 μL RIPA+10 μL蛋白酶抑制劑+100 μL磷酸酶抑制劑+10 μL PMSF)置于冰上,充分勻漿后4 ℃裂解30 min,4 ℃ 15 000 r/min離心10~15 min,取上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度。將待測(cè)蛋白樣本進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳,80 V進(jìn)行濃縮膠電泳,進(jìn)入分離膠電泳后將電壓調(diào)整為100 V,待條帶全部跑開至分離層膠下緣后停止電泳,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5% BSA封閉2 h,分別加入GFAP(1∶1 000)、OX42(1∶2 000)、SCN9A(1∶500)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜后,加入二抗[Navl.7的二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000),β-actin的二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000),GFAP的二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)],溫孵1 h。采用化學(xué)發(fā)光凝膠拍攝儀進(jìn)行凝膠圖像拍攝,ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)采用LSD法計(jì)算其統(tǒng)計(jì)值,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法計(jì)算其統(tǒng)計(jì)值,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
各組大鼠的PMWT基礎(chǔ)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常組大鼠PMWT值在第1、3、6、9、13天無(wú)顯著變化(P>0.05)。與正常組大鼠比較,空病毒組和慢病毒載體組大鼠PMWT值在建模后第1天明顯下降,在建模后第3天達(dá)到最低值,之后逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空病毒組大鼠比較,慢病毒載體組大鼠建模后第1天的PMWT值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),從建模后第3天開始,慢病毒載體組大鼠PMWT值逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。
圖1 各組大鼠機(jī)械痛閾值測(cè)定結(jié)果
各組大鼠的PTWL基礎(chǔ)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。正常組大鼠PTWL值在第1、3、6、9、13天差異無(wú)顯著變化(P>0.05)。與正常組大鼠比較,空病毒組PTWL值在建模后第1天明顯下降,在建模后第3天下降達(dá)最低值,之后較第3天升高,但仍低于基礎(chǔ)值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而慢病毒載體組大鼠PTWL值在建模后第1天明顯下降,在第3天達(dá)到最低值,之后逐漸升高,直至建模后第13天,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空病毒組大鼠比較,慢病毒載體組大鼠建模后第1天的PTWL值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),從建模后第3天開始,慢病毒載體組大鼠PTWL值逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。
圖2 各組大鼠熱刺激潛伏期測(cè)定結(jié)果
在建模后第3、6、13天,正常組大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)水平基本無(wú)變化。在建模后第3、6、13天,與正常組大鼠比較,空病毒組和慢病毒載體組大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在建模后第3、6、13天,與空病毒組大鼠比較,慢病毒載體組大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。
圖3 各組大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)
疼痛給患者及其家庭帶來(lái)了無(wú)盡的折磨,然而目前尚無(wú)讓醫(yī)師和患者都滿意的治療方法[9]。炎性疼痛模型由于建模方法簡(jiǎn)單,模型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),模型動(dòng)物的疼痛行為學(xué)改變明顯,在慢性疼痛研究中應(yīng)用廣泛[10]。通過(guò)足底注射CFA引起周圍炎癥,是目前慢性炎性疼痛最常用、最經(jīng)典的建模方法[11]。因此,本研究采用足底注射CFA建立慢性炎性疼痛模型。在疼痛治療研究中,常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括PMWT、PTWL、熱板反應(yīng)以及熱甩尾反應(yīng)等[12]。本研究將PMWT、PTWL作為疼痛研究指標(biāo),并以此判斷疼痛模型是否建立成功。有研究發(fā)現(xiàn),大鼠足底注射CFA后,PMWT顯著降低,PTWL明顯縮短[13]。本研究結(jié)果顯示,大鼠右后足注射CFA后,空病毒組大鼠在建模后第1天至第13天PMWT、PTWL值均明顯降低;鞘內(nèi)注射慢病毒載體后,PMWT、PTWL值明顯升高,表明鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi對(duì)大鼠的慢性炎性疼痛具有一定的改善作用,鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi能夠抑制Nav1.7的表達(dá),使疼痛閾值升高,從而明顯減輕慢性炎性疼痛。
DRG是痛覺(jué)信息傳入的第一級(jí)神經(jīng)元,其主要傳導(dǎo)外周傷害性信息,而傳遞這些電活動(dòng)的基礎(chǔ)就在于其細(xì)胞膜上的電壓門控性鈉通道,其與疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)[14]。有研究表明,編碼Nav1.7的SCN9A基因功能缺失性突變是導(dǎo)致痛覺(jué)完全消失的原因[15]。潘洪祥等[16]通過(guò)建立顳下頜關(guān)節(jié)炎性痛模型發(fā)現(xiàn),三叉神經(jīng)內(nèi)Nav1.7的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而參與調(diào)節(jié)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎性痛。本研究結(jié)果顯示,大鼠右后足注射CFA后,大鼠DRG中Nav1.7表達(dá)水平升高;鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi后,大鼠DRG中Nav1.7表達(dá)水平下降,表明鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi可抑制大鼠DRG中Nav1.7表達(dá),緩解慢性炎性疼痛,DRG中Nav1.7的表達(dá)與疼痛的產(chǎn)生密切相關(guān)。
脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化是引發(fā)疼痛的關(guān)鍵過(guò)程?;罨哪z質(zhì)細(xì)胞通過(guò)強(qiáng)化疼痛循環(huán)機(jī)制,維持機(jī)體疼痛狀態(tài)并將其放大[17]。GFAP主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞,CD11b/c單克隆抗體OX42能特異性標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞;GFAP和OX42均為膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)記物[18-19]。馬俊龍等[20]研究發(fā)現(xiàn),益氣活血通絡(luò)方可通過(guò)下調(diào)脊髓GFAP表達(dá)水平,抑制糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活性。馬俊杰等[21]對(duì)肌筋膜疼痛綜合征大鼠給予艾灸處理后,顯著降低了大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42的表達(dá),抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞活化,緩解了疼痛。本研究結(jié)果顯示,大鼠右后足底注射CFA后,脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)水平顯著增加;大鼠鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi后,脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá)水平顯著下降,表明鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi可能通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化,抑制大鼠脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá),從而抑制疼痛介質(zhì)的釋放和傳導(dǎo),進(jìn)而緩解慢性炎性疼痛。
綜上所述,鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi可能通過(guò)抑制大鼠DRG中Nav1.7表達(dá),抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而抑制大鼠脊髓GFAP、OX42蛋白表達(dá),發(fā)揮緩解慢性炎性疼痛的作用。但本研究?jī)H在整體動(dòng)物水平探討鞘內(nèi)注射LV-SCN9A-RNAi對(duì)疼痛的改善作用,尚缺少在細(xì)胞水平的深入研究作為佐證。