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    下調(diào)MAC30對(duì)乳腺癌細(xì)胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白的作用機(jī)制

    2023-06-09 02:35:36潘蕾蕾馬俊葉亭亭陳劍平宣城中心醫(yī)院心胸乳腺外科安徽宣城4000皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院甲乳外科安徽蕪湖4000
    局解手術(shù)學(xué)雜志 2023年6期
    關(guān)鍵詞:焦亡癌細(xì)胞培養(yǎng)基

    潘蕾蕾,馬俊,葉亭亭,陳劍平 (. 宣城中心醫(yī)院心胸乳腺外科,安徽 宣城 4000;. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院甲乳外科,安徽 蕪湖 4000)

    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,2020年乳腺癌新增人數(shù)約226萬(wàn),已經(jīng)超過肺癌成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。手術(shù)及放化療是臨床治療乳腺癌的主要方法,但放療抵抗或化療耐藥會(huì)影響患者療效及預(yù)后[2]。細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死,主要依賴Gasdermin(GSDM)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性。有研究表示,caspase-3可通過切割GSDM蛋白N端結(jié)構(gòu)增加細(xì)胞焦亡,從而降低癌細(xì)胞化療耐藥性[3]。乳腺癌細(xì)胞在缺血環(huán)境下無(wú)法進(jìn)行增殖及轉(zhuǎn)移,腫瘤血管生成可為癌細(xì)胞活化提供血供,從而促進(jìn)乳腺癌疾病進(jìn)展。因此,眾多學(xué)者認(rèn)為可將抑制腫瘤血管生成作為抗乳腺癌的靶點(diǎn)[4-5]?,F(xiàn)階段,在血管新生的病理生理過程中,細(xì)胞自噬作用持續(xù)存在,在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導(dǎo)的血管生成中,自噬相關(guān)信號(hào)可通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞表面內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)表達(dá)而促進(jìn)血管生成。有研究發(fā)現(xiàn),Na+-K+-ATP酶的α亞單位在腫瘤中存在異常表達(dá),對(duì)癌細(xì)胞增殖及遷移等具有調(diào)控作用[6]。Na+-K+-ATP酶α2亞基(ATP1A2)基因在乳腺癌中高表達(dá),其功能缺失會(huì)使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多,從而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。但ATP1A2基因與腫瘤血管生成及細(xì)胞自噬的關(guān)系目前尚不清楚。

    腦膜瘤相關(guān)蛋白(meningioma-associated protein,MAC30)是胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族成員之一,主要存在于細(xì)胞核的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,并在機(jī)體組織中廣泛表達(dá)[7]。在乳腺癌組織中MAC30表達(dá)升高,通過下調(diào)MAC30能夠抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移,但是關(guān)于下調(diào)MAC30對(duì)乳腺癌細(xì)胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白水平的影響目前尚未可知。因此,本研究通過體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞,觀察下調(diào)MAC30對(duì)乳腺癌的改善作用,以期為其治療提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞來源及細(xì)胞培養(yǎng)

    乳腺上皮細(xì)胞HMEC和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231、MCF-7、SKBR3均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心,于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng),24 h后棄去培養(yǎng)基,置于含1%雙抗的10%胎牛血清中培養(yǎng),培養(yǎng)條件同上,細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代,生長(zhǎng)至90%時(shí)終止消化反應(yīng),培養(yǎng)基中2~3 d傳代。

    1.2 試劑與儀器來源

    MAC30 Lenti-shRNA和陰性對(duì)照Lenti-shRNA(NC-shRNA)由上海吉?jiǎng)P基因公司合成;RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司;ATP1A2多克隆抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;鼠抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司;山羊抗小鼠IgG購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司;CCK-8法試劑盒購(gòu)自上海Beyotime公司;AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司;ECL顯色試劑盒購(gòu)自北京索寶萊科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):HBS-1096A)購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司;TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自湖南湘瑞生物有限公司;凝膠成像系統(tǒng)及Western blot電泳系統(tǒng)均購(gòu)自北京賽百奧科技有限公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

    1.3 qRT-PCR檢測(cè)HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)

    使用TRIzol法提取HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞中總RNA,無(wú)核酸酶溶解后轉(zhuǎn)錄為cDNA,獲得反應(yīng)體系,條件為:42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min,4 ℃終點(diǎn)。采用qRT-PCR檢測(cè),每個(gè)細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,上下游引物均為0.5 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)熱3 min,95 ℃ 5 s,58 ℃退火,40個(gè)循環(huán)。引物序列:MAC30上游為5'-CTCAGCCACATCCCC-3',下游為5'-CACAAGCTCG CAAAAC-3';β-actin上游為5'-GGAAATCGTGCGTGACATTA-3',下游為5'-GGAGCAATGATCTTG ATCTTC-3'。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中MAC30相對(duì)表達(dá)量。

    1.4 MCF-7細(xì)胞分組

    取MCF-7細(xì)胞,待生長(zhǎng)至50%~60%后采用培養(yǎng)基制成單個(gè)細(xì)胞懸液,分為乳腺癌組(MCF-7細(xì)胞)、NC組(MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAC30-NC-shRNA)、MAC30 shRNA組(MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAC30-shRNA)、ATP1A2組(MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATP1A2-shRNA)及MAC30 shRNA+ATP1A2組(MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAC30-shRNA、ATP1A2-shRNA)。

    1.5 MAC30 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染

    將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞制備成5×107/mL的細(xì)胞懸液,接種至6孔板中,37 ℃孵育24 h,待細(xì)胞達(dá)到30%時(shí)更換培養(yǎng)基,加入感染增強(qiáng)液,根據(jù)最佳感染復(fù)數(shù)及病毒滴度,加入MAC30 Lenti-shRNA和陰性對(duì)照NC-shRNA培養(yǎng)液,次日換掉病毒培養(yǎng)液,加入1 mg新鮮培養(yǎng)基,96 h后采用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

    1.6 ATP1A2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

    構(gòu)建TP1A2質(zhì)粒[7],將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋孔板80%~90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染,配制轉(zhuǎn)染混合液,將4 μg質(zhì)粒加入500 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中,將5 μL ip 2000加入500 μL無(wú)血清培養(yǎng)液混勻,室溫下靜置20 min。PBS沖洗3次,加入1 mL Lipo?fectamine 2000轉(zhuǎn)染混合液及無(wú)血清培養(yǎng)基1.5 mL,培養(yǎng)6 h后,換成常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

    1.7 MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    采用CCK-8法檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞增殖情況。將5×103個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞接種至96孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h后,加入CCK-8試劑(5 g/L),每孔20 μL,再加入200 μL二甲基亞砜溶液,充分溶解15 min,分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)取出培養(yǎng)板,在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度OD值,實(shí)驗(yàn)3次,復(fù)孔2次。

    1.8 MCF-7細(xì)胞焦亡實(shí)驗(yàn)

    100 μL的Binding buffer重懸細(xì)胞后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI混合液,室溫避光孵育15 min,再加入400 μL含Binding buffer的細(xì)胞懸液,30 min后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。以AnnexinV-FITC+/PI+雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率作為焦亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.9 體外血管形成實(shí)驗(yàn)

    取48孔板,于冰上每孔加入60 μL基質(zhì)膠溶液,然后在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱靜置30 min使其凝固,取各組細(xì)胞進(jìn)行消化、離心,棄掉上清液后重懸細(xì)胞,調(diào)整密度為2×105/mL接種于24孔板,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),48 h后置于倒置顯微鏡下觀察。計(jì)算5個(gè)視野的血管管腔數(shù)目,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.10 Westerm blot檢測(cè)各組細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平

    10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白(40 μg),轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后再用5%脫脂奶粉封閉2~3 h,加入一抗ATP1A2(1∶100)、SCr(1∶200)、AKT(1∶150)、PI3K(1∶200),內(nèi)參為GAPDH(1∶2 000),4 ℃搖床孵育過夜。TBST沖洗3次,室溫下與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)結(jié)合孵育2 h,雜交沖洗。然后將膜浸入ECL工作液,計(jì)算目標(biāo)蛋白與GAPHD之間的OD值,檢測(cè)相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用GraphPad Prism 8軟件分析數(shù)據(jù),各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用方差分析,事后檢驗(yàn)采用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)

    與HMEC細(xì)胞相比,MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05),其中MCF-7細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)水平最高,見圖1。故本研究選擇MCF-7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖1 HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)

    2.2 各組MCF-7細(xì)胞中MAC30 mRNA表達(dá)

    乳腺癌組與NC組MAC30 mRNA表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組和NC組相比,MAC30 shRNA組MAC30 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與MAC30 shRNA組相比,ATP1A2組MAC30 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與ATP1A2組相比,MAC30 shRNA+ATP1A2組MAC30 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),見圖2。

    圖2 各組MCF-7細(xì)胞中MAC30 mRNA表達(dá)

    2.3 各組MCF-7細(xì)胞增殖活性比較

    24 h、48 h、72 h及96 h時(shí),乳腺癌組與NC組MCF-7細(xì)胞增殖活性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組和NC組相比,MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞增殖活性均降低(P<0.05);MAC30 shRNA組與ATP1A2組細(xì)胞增殖活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與MAC30 shRNA組和ATP1A2組相比,MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05),見圖3。

    圖3 各組MCF-7細(xì)胞增殖活性

    2.4 各組MCF-7細(xì)胞焦亡率比較

    MAC30 shRNA及ATP1A2質(zhì)粒均可以誘發(fā)MCF-7細(xì)胞形態(tài)改變,主要體現(xiàn)在細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞顆粒增多及大量焦亡。細(xì)胞之間連接較少,以MAC30 shRNA+ATP1A2組最佳,培養(yǎng)液出現(xiàn)大量細(xì)胞懸浮,見圖4a。乳腺癌組與NC組MCF-7細(xì)胞焦亡率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組和NC組比較,MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組MCF-7細(xì)胞焦亡率均升高,其中MAC30 shRNA+ATP1A2組最高,而MAC30 shRNA組與ATP1A2組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖4b。

    圖4 各組MCF-7細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞焦亡率比較

    2.5 各組MCF-7細(xì)胞血管形成數(shù)目比較

    乳腺癌組與NC組細(xì)胞血管形成數(shù)目比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組和NC組相比,MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞血管形成數(shù)目減少(P<0.05),MAC30 shRNA組與ATP1A2組細(xì)胞血管形成數(shù)目比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與MAC30 shRNA組和ATP1A2組相比,MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞血管形成數(shù)目減少(P<0.05),見圖5。

    圖5 各組MCF-7細(xì)胞血管形成比較( ×200)

    2.6 各組MCF-7細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平比較

    乳腺癌組與NC組細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組和NC組相比,MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平降低(P<0.05);MAC30 shRNA組與ATP1A2組ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與MAC30 shRNA組和ATP1A2組相比,MAC30 shRNA+ATP1A2組ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平降低(P<0.05),見圖6。

    圖6 各組MCF-7細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平比較

    3 討論

    乳腺癌是我國(guó)發(fā)病率居首位的惡性腫瘤[8]。研究其治療機(jī)制對(duì)于提高臨床治療效果、延長(zhǎng)患者預(yù)后具有重要作用。本研究通過觀察下調(diào)MAC30對(duì)乳腺癌細(xì)胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白水平的影響,為乳腺癌的治療提供參考。

    MAC30是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族成員之一,位于染色體17q11.2,具有調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)活性的作用[9]。MAC30在人體內(nèi)(包括肝細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等)廣泛分布,在某些癌細(xì)胞和癌組織中也有表達(dá)[10]。MAC30在不同惡性腫瘤中的表達(dá)存在差異,如在胰腺癌[11]中呈低表達(dá),而在胃癌[11]、結(jié)腸癌[11]及卵巢癌[12]中呈高表達(dá)。MAC30可能參與乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。乳腺癌組織中MAC30的表達(dá)高于正常組織。此外,腫瘤細(xì)胞表面的MAC30與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)能力和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。因此,MAC30也被認(rèn)為是開發(fā)抗腫瘤藥物的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。在乳腺癌中MAC30過表達(dá)可被乳腺癌易感基因1(breast cancer1,BRCA1)誘導(dǎo)后突變,進(jìn)而加快疾病進(jìn)展。MAC30作為細(xì)胞內(nèi)孤兒受體,可與sigma2受體結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及分化[13]。本研究結(jié)果表明,在乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)MAC30可抑制癌細(xì)胞增殖,加快焦亡。有研究證實(shí),在胃癌細(xì)胞中抑制MAC30可降低蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/AKT磷酸化及細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)活化,進(jìn)而降低胃癌細(xì)胞活性,推測(cè)MAC30表達(dá)與腫瘤細(xì)胞活性相關(guān)[14]。細(xì)胞焦亡作為細(xì)胞程序性死亡的方式之一,當(dāng)細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)GSDMD活性升高,可通過促進(jìn)細(xì)胞膜裂解而加快腫瘤細(xì)胞死亡[15]。下調(diào)MAC30可加快癌細(xì)胞焦亡,推測(cè)機(jī)制為抑制MAC30后磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/AKT受到抑制,可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞焦亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。

    當(dāng)腫瘤體積較小時(shí),由于腫瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等的需求量相對(duì)較低,可以通過彌散方式從周圍組織中攝取所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但當(dāng)腫瘤體積增大到一定程度時(shí),彌散方式無(wú)法滿足腫瘤細(xì)胞的需求,腫瘤細(xì)胞就會(huì)陷入缺氧狀態(tài)。為了維持生長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞開始釋放一系列生長(zhǎng)因子(如VEGF等)來刺激周圍血管的生長(zhǎng)和形成[16]。乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)激活可加快VEGF表達(dá),進(jìn)而加快細(xì)胞侵襲,誘導(dǎo)腫瘤血管形成[17-18]。本研究結(jié)果表明,下調(diào)MAC30可抑制乳腺癌細(xì)胞血管生成,從而抑制腫瘤生長(zhǎng),阻止疾病發(fā)展。MAC30雖然為IGF家族成員之一,但與IGF-1并不完全相同。MAC30在乳腺癌細(xì)胞中與IGF-1的表達(dá)水平一致。有研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌細(xì)胞中,IGF-1的表達(dá)水平升高,并通過激活下游PI3K/AKT等,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[19-20]。在乳腺癌細(xì)胞中IGF-1表達(dá)升高并參與腫瘤血管生成,因此推測(cè)下調(diào)MAC30可以抑制IGF-1活性,降低腫瘤組織中VEGF表達(dá),減少血管形成數(shù)目,從而改善病情。本研究結(jié)果表明,下調(diào)MAC30后對(duì)ATP1A2活性具有調(diào)節(jié)作用,可以抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

    ATP1A2是一個(gè)編碼鈉鉀泵α2亞基的基因,在細(xì)胞膜上扮演著重要的離子輸送功能。現(xiàn)階段,隨著對(duì)ATP1A2基因研究的深入,其被認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系。有研究表明,ATP1A2在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織,且ATP1A2高表達(dá)乳腺癌患者預(yù)后往往不佳[21]。ATP1A2對(duì)腫瘤細(xì)胞生物活性具有調(diào)控作用。有研究表明,上調(diào)ATP1A2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而對(duì)其抑制后則能夠減少乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。本研究推測(cè)在乳腺癌中,MAC30的過表達(dá)可以調(diào)節(jié)SCr/PI3K/AKT通路的活性,從而促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲,相反的抑制MAC30可能降低SCr/PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá),從而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用。本研究表明下調(diào)MAC30可以抑制ATP1A2、SCr、PI3K、AKT表達(dá),進(jìn)而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng),減少血管生成,加快焦亡。

    綜上所述,下調(diào)MAC30可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及血管生成,加快焦亡,其機(jī)制與抑制ATP1A2表達(dá)相關(guān)。但本研究未進(jìn)行動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn),關(guān)于MAC30調(diào)節(jié)ATP1A2的相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

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