液滴式數(shù)字PCR檢測尿路上皮癌患者尿cfDNA中FGFR3基因S249C突變的臨床應用價值

祖麗胡馬爾·艾孜木阿吉，趙 煥，馬 晟，高 苒，王雅茹，肖 汀，

(1．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學國家重點實驗室，癌發(fā)生及預防分子機理北京市重點實驗室，北京 100021；2．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院，病理科，北京100021；3．中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100021)

尿路上皮癌(urothelial carcinoma，UC)是起源于尿路上皮的一種多源性惡性腫瘤，包括膀胱癌(bladder cancer，BC)和上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)，是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1-3]。目前膀胱鏡和尿脫落細胞學檢查是監(jiān)測UC的金標準。但膀胱鏡的局限性在于對UTUC和原位癌難以活檢，且有創(chuàng)不適合作為常規(guī)監(jiān)測的方法[4]。尿脫落細胞學雖屬于特異度高的無創(chuàng)檢查，但因其靈敏度有限從而容易漏診[5-6]。尋找可輔助尿脫落細胞學檢查并提高UC檢出率的非侵入性生物標志物是UC診治的研究重點。

隨著“精準醫(yī)學”概念的普及，液體活檢作為無創(chuàng)診療是腫瘤精準醫(yī)學的發(fā)展方向之一。在泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，由于尿液與腫瘤直接接觸，使得尿游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)檢測成為最常用的一種液體活檢方法[7]。cfDNA的檢測可以獨立于細胞形態(tài)學，甚至早于細胞形態(tài)的改變檢測出靶基因的突變狀態(tài)。有研究表明接受過膀胱切除術的患者尿cfDNA 中拷貝數(shù)水平預示著腫瘤復發(fā)的可能，而且在與循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)關聯(lián)時其預測結果更為明顯[8]。但由于尿cfDNA 濃度低DNA 含量較少，已有的傳統(tǒng)基因檢測手段如Sanger 測序等無法精準檢測DNA含量低的樣本，所以另一種靈敏度更高的檢測方法成為了檢測尿cfDNA 的重要手段。液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年來發(fā)展起來的一種突破性定量的分析技術，這種高靈敏的技術已經(jīng)證明了其在絕對定量、稀有事件檢測、拷貝數(shù)變異、基因表達和定量miRNA等應用中的可靠性[9]。

成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3)基因被認為是膀胱癌患者尿液細胞中具有潛能的生物標志物[10]。位于FGFR3第7號外顯子上的S249C 位點是最常見的突變位點(TCC→TGC)[11]，S249C 突變型受體中的半胱氨酸殘基可以使突變型單體在胞外形成二硫鍵從而觸發(fā)激酶的激活[12]，這會持續(xù)激活下游細胞的增殖途徑并減少細胞凋亡[13]，有研究表明該突變會導致乳頭狀膀胱癌的形成[14]。Montalbo等[15]對尿脫落細胞學診斷不明確的樣本通過多重PCR與SNapShot的方法聯(lián)用檢測FGFR3基因突變，結果發(fā)現(xiàn)由于檢測突變率較低無法評估其對于尿脫落細胞學診斷不明確樣本的臨床意義。Christensen 等[16]利用ddPCR 方法檢測尿cfDNA 和血漿ctDNA中FGFR3和PIK3CA突變位點，結果表明UC患者尿cfDNA 突變拷貝數(shù)水平與腫瘤階段、等級和大小呈正相關，尿cfDNA中高拷貝數(shù)能提示疾病的進展。

本研究采用ddPCR 方法檢測UC 患者尿cfDNA 中FGFR3S249C突變情況，以輔助提高尿脫落細胞學診斷不明確的樣本對于UC的診斷效能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 選取2020年11月—2021年7月在中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院就診的泌尿系統(tǒng)疾病患者。前瞻性收集臨床懷疑有尿路上皮病變患者尿液(送檢尿量＞200 mL)，納入分析的實驗組標準：經(jīng)膀胱鏡或術后組織病理結果確診為尿路上皮癌；納入分析的對照組標準：經(jīng)膀胱鏡或術后組織病理結果確診為良性。排除標準：非尿路上皮病變，或有其他系統(tǒng)的惡性腫瘤史。

1.1.2 樣本量估算 引用公式n=Uα2P(1-P)/δ2。n=預估樣本量；Uα=正態(tài)分布中累積概率為α/2 的U值；U0.05=1.96；P值分別為：預估FGFR3用于診斷尿路上皮癌的靈敏度(0.80)和診斷尿路皮癌的特異度(0.90)；δ=允許誤差(通常定為0.05～0.10)。計算得出預估所需樣本量為30。

1.1.3 實驗試劑 提取尿cfDNA 所需試劑Quick-DNA Urine Kit(含尿液穩(wěn)定劑)購于Zymo research 公司；QubitTMdsDNA HS and BR Assay Kits 購于Invitrogen 公司。ddPCR 所需ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)、微滴生成油、ddPCRTM微滴讀取油、DG8TMCartridges and Gaskets、DG8 Cartridge Holder、Pierceable Foil Heat Seal、PCR 半裙邊96 孔板和探針FGFR3 pS249C_dHsaMDV2516760(20×)均購自Bio-Rad 公司；UltraPureTMDNase/RNase-Free 雙蒸水購于Invitrogen公司。

1.1.4 實驗儀器 QX200TMDroplet reader、QX200TMDroplet Generator、PX1 PCR Plate Sealer 和T100熱循環(huán)儀均購于Bio-Rad公司；DRAGON LAB MX-F渦旋儀購于Dragon公司；恒溫水浴鍋購于北京醫(yī)療器械公司；Qubit 3.0購于Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 尿cfDNA 提取 選擇送檢尿量大于200 mL者，混勻后留取40 mL，2500 g/min離心后留上清液加入尿液穩(wěn)定劑(每1 mL 尿加入70 μL 尿液穩(wěn)定劑)，以備DNA 提取。另外150 mL 尿用于尿脫落細胞學診斷制片。

尿cfDNA 提取分為3 個步驟：總DNA(游離)沉淀、蛋白消化、DNA 純化。①將已加入尿液穩(wěn)定劑的40 mL 尿液轉移到合適的離心管內，并加入20 μL 純化珠，3000 g 離心15 min，收集細胞沉淀。②棄去上清后不攪動細胞沉淀，保留大約100-400 μL 細胞沉淀，并向其中加入等體積的尿液細胞消化液，重懸。將5%的蛋白酶K加到重懸的細胞沉淀中，渦旋混勻，在55 ℃下孵育30 min。③添加1倍體積的基因組裂解液到消化完后的混合液中，并渦旋混勻。將全部樣品轉移到Zymo-SpinTMIC-S 柱中，Zymo-SpinTMIC-S 柱套在一個收集管后16000 g離心(下同)1 min，去除濾出液后，重復上述步驟。將Zymo-SpinTMIC-S柱套在新的收集管中，加入200 μL Urine DNA Prep Buffer 到離心柱中，離心1 min，棄去濾出液。將700 μL Urine DNA Wash Buffer 放置到離心柱中離心1 min，棄去濾出液。再用200 μL Urine DNA Wash Buffer重復上步驟。將離心柱轉移到不含DNase/RNase-free 的EP管中，加入10 μL DNA 洗脫液到基質上，室溫下放置3～5 min，全速離心1 min 來洗脫DNA。cfDNA 濃度采用Qubit 3.0 熒光定量儀測定，選取濃度＞0.3 ng/μL的cfDNA樣本進行ddPCR檢測。

1.2.2 ddPCR 檢測尿cfDNA 中FGFR3S249C 突變進行ddPCR 檢測的流程有配制反應液、制備微滴、PCR擴增、讀取微滴、分析數(shù)據(jù)。①配置反應液：探針1 μL，ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)11 μL，模板1 μL，UltraPuretm DNase/RNase-Free 雙蒸水加至終體積為20 μL。②制備油滴：在DG8 cartridge中間的8個孔內分別加入20 μL配置好的反應液，加樣時需避免引入氣泡。將70 μL微滴生成油加入到DG8 cartridge 最下方的8 個孔中蓋上DG8TMGaskets，并鉤牢兩邊小孔。制備好的DG8 Cartridge Holder 輕放于QX200TMDroplet Generator 中并生成微滴。③PCR 擴增：DG8TMcartridge 最上排孔內為已生成的微滴，在96 孔板內緩慢打入已生成的微滴，將PX1熱封儀提前預熱對已鋪好微滴液的96孔板進行封膜，運行熱封儀的程序為180 ℃，5 s。PCR反應需在封膜后的30 min內進行：95 ℃、 10 min；39個循環(huán)94 ℃、30 s，55 ℃、1 min；98 ℃、10 min，16 ℃保存(升降溫速度2.5 ℃/s)。④讀取微滴，分析數(shù)據(jù)：在plate holder 中放入已完成PCR 的96 孔板組裝好后放入到QX200TMDroplet reader 中，使用QuantaSoft 軟件進行檢測并對數(shù)據(jù)進行分析，ddPCR 反應總微滴數(shù)＞10000 的樣本納入后續(xù)分析。按下式計算突變等位基因頻率(mutation allele frequency，MAF)，MAF 是ddPCR 讀出的突變型拷貝數(shù)占總拷貝數(shù)的比例，是判定該樣本是否有突變的重要標準[17-18]。

以往研究報道使用與本研究相一致的BioRad QX200 系統(tǒng)和實驗試劑去檢測尿cfDNA 中FGFR3S249C突變位點[19-20]，對突變結果進行判讀的統(tǒng)一標準為：MAF＞0.1%；突變陽性微滴≥3。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0 進行統(tǒng)計學分析。本研究中對MAF 和cfDNA 濃度等計量資料進行Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗后，不符合正態(tài)分布故該計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。分類變量使用Fisher 精準檢驗進行比較。金標準是以膀胱鏡檢查或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術病理診斷結果為準。繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，以尿脫落細胞學SHGUC 且病理結果診斷為UC 的患者作為實驗組，以尿脫落細胞學結果是NHGUC且病理結果中未見腫瘤的患者為對照組，使用R語言中的pROC、ROCit 包分別計算出個截點上FGFR3S249C 突變對于診斷UC 的靈敏度和特異度，繪制出ROC曲線；曲線下的面積在0.5和1之間，AUC越接近于1，說明診斷效果越好，AUC在0.5～0.7時有較低準確性，AUC在0.7～0.9時有一定準確性，AUC 在0.9 以上時有較高準確性。作圖使用GraphPad Prism 9.0.2。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般臨床資料

符合納入和排除標準且ddPCR下機數(shù)據(jù)可納入分析(總微滴數(shù)大于10000)的樣本例數(shù)共27例UC。男性19 例，女性8 例；年齡范圍36～77 歲，年齡中位數(shù)64歲。按照尿液細胞學巴黎報告系統(tǒng)(the Paris system for reporting urinary cytology，TPS)將納入的27例患者分為16 例高級別尿路上皮癌(high-grade urothelial carcinoma，HGUC)，8 例可疑高級別尿路上皮癌(suspicious for high-grade urothelial carcinoma，SHGUC)，3 例未見高級別尿路上皮癌(negative for high-grade urothelial carcinoma，NHGUC)。27例UC 患者中26例患者接受了手術治療，其組織病理結果按照2016年《WHO 泌尿系統(tǒng)及男性生殖器官腫瘤分類》標準(第4版)進行分類，高級別UC 19 例，低級別UC 5 例，未見腫瘤2 例，未做手術1 例。按照2017年第8 版美國癌癥分期聯(lián)合委員會(AJCC)制訂的TNM分期系統(tǒng)進行分期：3 例Ta，2 例T0，8 例T1，5 例T2，7 例T3，2例無T分期；浸潤性UC 19例，非浸潤性UC 4例。

2.2 尿cfDNA中FGFR3 S249C突變情況

采用ddPCR檢測尿cfDNA中FGFR3S249C突變情況，結果見表1。從納入研究的UC患者尿液中提取的DNA 濃度最低為0.348 ng/μL，通過ddPCR 可檢測到該濃度樣本的突變拷貝數(shù)MAF 值為39.6%，說明本研究中ddPCR 可檢測到cfDNA 濃度低樣本的突變基因。SHGUC組cfDNA中位濃度為17.05 ng/μL，高于HGUC組中的中位濃度16.65 ng/μL；HGUC 組cfDNA 濃度整體相比于SHGUC 組有上升趨勢；NHGUC 組中cfDNA中位濃度均低于HGUC 和SHGUC 組。SHGUC 組中MAF 中位值為0.24%，高于HGUC 組中的中位MAF 值0.01%。

表1 各尿脫落細胞學不同分級中尿cfDNA 濃度和ddPCR 檢測后的MAF值[M(P25，P75)]

通過ddPCR 檢測方法在患者尿cfDNA 中檢測到的微滴熒光信號以二維熒光增量圖的形式展示，在陰、陽性液滴可以做最佳區(qū)分的位置上設定陰、陽性截斷值，從而得出樣本野生型拷貝數(shù)和突變型拷貝數(shù)，結果見圖1。

2.3 FGFR3 S249C在不同尿脫落細胞學和病理分型中的突變率分析結果

27 例UC 患者尿cfDNA 樣本中有7 例為FGFR3S249C 突變陽性，檢出率為25.9%(7/27)。在T 分期的T1 中FGFR3S249C 突變率為37.5%(3/8)。按病理結果分類FGFR3S249C 在高級別中突變率為26.3%(5/19)，低級別中為40.0%(2/5)，未見腫瘤類型中為0(0/2)。按尿脫落細胞結果分類FGFR3S249C在HGUC中突變率為18.8%(3/16)，SHGUC中為50%(4/8)，NHGUC中為0(0/3)。在浸潤性UC中FGFR3S249C的突變率為31.6%(6/19)，在非浸潤性UC 中其突變率為25%(1/4)。見表2。

表2 FGFR3突變與臨床病理相關指標的關系[例數(shù)(百分比)]

FGFR3S249C 在病理分級及細胞學均為高級別UC 的樣本中突變率為23.1%(3/13)，在病理分級為高級別UC、細胞學為可疑高級別UC 的樣本中突變率為40%(2/5)，在病理分級為低級別UC、細胞學為可疑高級別UC的樣本中突變率為66.7%(2/3)。見圖2。

圖2 按病理分類概述ddPCR檢測FGFR3 S249C的突變結果

2.4 ddPCR 檢測FGFR3 突變對尿脫落細胞學SHGUC的診斷效能

8例尿脫落細胞學診斷為SHGUC的樣本其病理均診斷為UC，使用ddPCR 檢測這8 例SHGUC 中FGFR3S249C 突變陽性的樣本可提高50%(4/8)的UC 檢出率。在SHGUC 樣本中使用ddPCR 檢測FGFR3S249C 突變，繪制ROC 并進行分析，結果顯示AUC=0.781，95% CI(0.407，1.000)；靈敏度為62.5%，特異度為100%，陽性預測值100%，陰性預測值40%，約登指數(shù)0.625。證明使用ddPCR 檢測FGFR3S249C 可輔助尿脫落細胞學提高對UC的診斷效能。見表3和圖3。

表3 尿脫落細胞學檢測結果為SHGUC的患者FGFR3突變情況與臨床資料

圖3 FGFR3突變預測UC的診斷效能

3 討論

尿脫落細胞學檢查是診斷UC 特異度高的非侵入性檢測方式，但其靈敏度較低且細胞學結果為可疑的患者會有被漏診的風險。ddPCR 對于體液活檢中像cfDNA 這類DNA 含量少的樣本具有高靈敏度和特異度，且理論上ddPCR 可檢測出突變頻率遠低于1%的基因[21]。本研究中使用ddPCR 可檢測出cfDNA 濃度0.348 ng/μL 樣本中的突變拷貝數(shù)且MAF 值為39.6%，這進一步體現(xiàn)ddPCR對于樣本中DNA含量少所具有的檢出效能。Montalbo 等[15]采用多重PCR 與SNapShot 的方法聯(lián)用檢測FGFR3基因突變，在29 例細胞學診斷為非典型尿路上皮癌的樣本中僅有1 例為FGFR3S249C 突變，其檢出率較低。SNaPshot 雖然可以快速分析大量的SNP位點，但因為SNapShot靈敏度低存在假陽性或假陰性結果的風險；而ddPCR 相比于SNaPshot 靈敏度更高，可以減少這種風險并提供更精準的檢測結果[22]。在實驗方法上SNapShot的DNA上樣量需要5 ng，與此相比之下，進行ddPCR檢測時DNA上樣量僅需1 ng也可有效擴增出DNA片段[23]。故在本研究中應用高靈敏度和特異度的ddPCR 檢測UC 患者中FGFR3S249C 突變情況，旨在輔助提高對于UC 的檢出率。

本研究中ddPCR 反應后進行數(shù)據(jù)分析將MAF＞0.1%且陽性微滴數(shù)＞3 的樣本定義為FGFR3突變陽性，該突變對于UC 的檢出率為25.9%(7/27)。Hayashi等[20]研究者利用ddPCR 方法從153 名患者(含56 名UTUC 患者)尿上清中提取cfDNA 檢測TERT和FGFR3熱突變位點，UTUC患者cfDNA中TERTC228T突變率為39.3%，TERTC250T 突變率為7.1%，F(xiàn)GFR3S249C 突變率為16.1%，結合細胞學檢測結果計算出其特異度和靈敏度分別是96.0%和78.6%。已被FDA批準用于檢測膀胱癌的診斷工具UroVysion、NMP22等可作為非侵入性方式預測膀胱癌。目前有研究表明，尿脫落細胞學結合尿液cfDNA 診斷膀胱癌敏感性(77.5%)要高于尿脫落細胞學結合UroVysion(67.5%)[19]。這進一步說明我們的結果與以往研究有一致性的同時，F(xiàn)GFR3S249C 突變對于UC 的診斷效能有一定臨床應用價值。本研究結果的重要之處是對于尿脫落細胞學診斷不明確但病理結果為UC 的樣本中，F(xiàn)GFR3S249C突變檢測可以提高UC檢出率且具有一定的診斷效能。

本研究從尿液中提取cfDNA 濃度在各尿脫落細胞學HGUC 和SHGUC 中濃度都有升高的趨勢，且在HGUC 組和SHGUC 組中MAF 值均較高。尤其在SHGUC 組中當不明確是否是高級別UC 時，F(xiàn)GFR3S249C 突變陽性可輔助診斷SHGUC 以提高UC 診斷效能。SHGUC 中FGFR3S249C突變對UC 檢出率為50%[AUC=0.781，95% CI(0.407，1.000)]，這提示在尿cfDNA中使用ddPCR檢測FGFR3S249C的突變對診斷UC有一定的輔助作用。由于尿cfDNA提取并對其進行ddPCR 檢測存在一定的技術難度，導致可納入到本研究的合格樣本數(shù)量較少，所以該研究結論還需要進一步擴大樣本量來進行驗證。

綜上所述，使用ddPCR 檢測尿cfDNA 中FGFR3S249C 突變作為一種非侵入性的檢測方式可以輔助提高尿脫落細胞學診斷不明確樣本的診斷效能。該方法將在臨床上對于提高UC的早期篩查能力，輔助UC患者術前診斷、術后復發(fā)監(jiān)測及預后判斷上提供一定的參考依據(jù)。