分光光度法測定醬油種曲的孢子數(shù)

李興周，劉建華，李遠(yuǎn)珍，黃佳玲

（廣東廚邦食品有限公司，廣東陽江 529500）

醬油釀造主要包括醬油種曲培養(yǎng)、大曲培養(yǎng)、曬場發(fā)酵三大過程，其釀造的第一步是生產(chǎn)優(yōu)良的種曲，即米曲霉的擴大培養(yǎng)物，它要求孢子健壯、數(shù)量多[1]。種曲孢子數(shù)是衡量種曲質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，要求孢子數(shù)大于90億個/g干基[2]。目前，醬油種曲孢子數(shù)的檢測方法主要參照《孢子數(shù)測定法》（SB/T 10315——1999），即血球計數(shù)法。在計測孢子數(shù)的實際操作中，需先對樣品進(jìn)行稀釋、再取其稀釋液制片、而后鏡檢計數(shù)，其中制片后往往需靜置2～3 min使孢子沉降再鏡檢計數(shù)，單個樣品鏡檢計數(shù)時間約10～15 min，且需鏡檢計數(shù)2次以上，再取其平均值作為檢測結(jié)果，因此單個樣品制片與鏡檢計數(shù)約需30 min，該檢測方法費時費力且2次鏡檢計數(shù)結(jié)果偏差較大。

有少量文獻(xiàn)報道采用光電比濁法測定頂頭孢霉菌、黑曲霉、白地霉和康寧木霉孢子數(shù)，該方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確的特點[3-4]。本實驗嘗試采用分光光度法對醬油種曲的孢子數(shù)進(jìn)行測定，且與上述血球計數(shù)法進(jìn)行對比分析，以達(dá)到用分光光度法替代血球計數(shù)法，為醬油種曲孢子的計數(shù)提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確的測定方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

醬油種曲（米曲霉），由廣東廚邦食品有限公司提供。

乙醇（95%），分析純，廣東廣試試劑科技有限公司；稀硫酸，自配，濃硫酸與水按體積比1∶9混合均勻即可。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA RH磁力攪拌器，廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司；25×16血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；T6新銳可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣液的制備

（1）稱樣。稱取成熟醬油種曲（黃綠色、孢子多）（1±0.001） g，置于250 mL三角瓶內(nèi)。

（2）孢子分散。向三角瓶內(nèi)加入10 mL 95%乙醇、20 mL純水及10 mL稀硫酸，再加入一小勺的玻璃珠和1顆攪拌子，置于磁力攪拌器電磁板上攪拌，以1 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌30 min，使孢子個個分散。

（3）過濾定容。將分散后的樣品使用100目紗布過濾至500 mL容量瓶中，采用純水沖洗曲渣，務(wù)使濾渣不含孢子，再定容，倒置搖勻獲得標(biāo)準(zhǔn)樣液（每次使用/計數(shù)前需先將容量瓶上下顛倒10次搖勻）。

（4）標(biāo)準(zhǔn)樣液計數(shù)。使用1 mL刻度吸管吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)樣液，用濾紙擦干吸管外表面的余液，使標(biāo)準(zhǔn)樣液從吸管中勻速滴出，取中間2滴于血球計數(shù)板的兩個計數(shù)室上，再將蓋片輕輕由一邊向另一邊壓下，使蓋片與計數(shù)板完全密合、液中無氣泡，靜置3 min，待孢子自然沉降后使用顯微鏡鏡檢計數(shù)，最后計算結(jié)果。做3次重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)樣液計數(shù)，取平均值作為標(biāo)準(zhǔn)樣液對應(yīng)醬油種曲的濕基孢子數(shù)[5]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管分別移取標(biāo)準(zhǔn)樣液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL和50 mL于50 mL容量瓶中，用純水稀釋至刻度，搖勻，以95%乙醇∶稀硫酸∶純水=1∶1∶48的混合液為參比，在480 nm處用可見分光光度計測定其吸光度（每次測定前需將容量瓶中溶液上下顛倒10次搖勻，每個稀釋度檢測3次取平均值），以醬油種曲的濕基孢子數(shù)為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 醬油種曲干基孢子數(shù)的測定

（1）稱樣。同1.3.1稱樣中的操作。

（2）孢子分散。同1.3.1孢子分散中的操作。

（3）過濾定容。將分散后的樣品使用100目紗布過濾至1 000 mL容量瓶中，采用純水沖洗曲渣，務(wù)使濾渣不含孢子，再定容，倒置搖勻，即得樣品測試液（每次測定前需先將容量瓶上下顛倒10次搖勻）。

（4）樣品測定。取適量的樣品測試液至比色皿中，參照“1.3.2”項下方法在480 nm處測定吸光度，計算測定結(jié)果。

（5）醬油種曲干基孢子數(shù)的計算。計算公式為

其中，醬油種曲水分含量的檢測參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（GB 5009.3——2016）[6]。

1.3.4 精密度實驗

取適量1.3.3方法中的樣品測試液至比色皿中，在波長480 nm處測定吸光度，連續(xù)測定6次，計算結(jié)果。

1.3.5 重復(fù)性實驗

取同批次醬油種曲樣品，按照1.3.3（1）～（3）中的操作方法平行制備5份樣品測試液，參照“1.3.2”項下方法在480 nm處測定吸光度，計算測定結(jié)果。

1.3.6 方法對比

隨機選取醬油種曲1#、醬油種曲2#、醬油種曲3#、醬油種曲4#、醬油種曲5#和醬油種曲6#共6批次成熟種曲作為實驗樣品，由2名操作熟練的檢測人員各對3批次樣品分別采用本法與血球計數(shù)法（參照1.3.1項下操作方法）進(jìn)行孢子數(shù)測定，每個樣品測定/計數(shù)2次，計算其干基孢子數(shù)，對比同一方法2次測定結(jié)果與同一樣品兩種方法的測定結(jié)果，從而分析確定分光光度法能否替代血球計數(shù)法測定醬油種曲的孢子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

按照1.3.2的方法進(jìn)行考察，以醬油種曲的濕基孢子數(shù)為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為y=93.70x-1.53，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，其擬合程度高。由圖1可知，該方法測定醬油種曲的濕基孢子數(shù)在14～72億個/g線性關(guān)系良好。

圖1 濕基孢子數(shù)與吸光度的關(guān)系

2.2 精密度考察結(jié)果

按照1.3.4方法進(jìn)行精密度考察，測定6次吸光度分別為0.353、0.348、0.359、0.351、0.345和0.356，平均吸光度為0.352，6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.62%，表明該方法測定結(jié)果的精密度良好。

2.3 重復(fù)性考察結(jié)果

按照1.3.5方法進(jìn)行重復(fù)性考察，該同批次醬油種曲樣品的干基孢子數(shù)分別為122.75億個/g、118.89億個/g、120.67億個/g、118.29億個/g、116.80億個/g，平均干基孢子數(shù)為119.48億個/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.92%。結(jié)果表明，本實驗方法的測定結(jié)果重復(fù)性高、方法穩(wěn)定（表1）。

表1 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.4 方法對比結(jié)果

不同分析方法間測定結(jié)果的比較，用于判斷兩方法間一致性，是檢測實驗室經(jīng)常遇到的實際問題。新方法與經(jīng)典方法間的比較，特別是在缺少標(biāo)準(zhǔn)樣品，不滿足t值檢驗的數(shù)據(jù)條件下，選用合適判據(jù)尤其重要?？煽紤]采用每組樣品分別用兩種方法測量一次，取兩方法測定結(jié)果相對偏差，與實驗室間相關(guān)偏差限值進(jìn)行比較，用合格率大小判斷兩方法結(jié)果一致性程度[7]。本實驗分別采用血球計數(shù)法與本法對醬油種曲1～6#的干基孢子數(shù)進(jìn)行測定，計算同一方法2次測定結(jié)果與同一樣品兩種方法測定結(jié)果的相對偏差，結(jié)合醬油種曲干基孢子數(shù)測定結(jié)果相對偏差≤15%的控制要求計算相對偏差合格率，其結(jié)果如表2所示。

表2 方法對比實驗結(jié)果

由表2可知，采用血球計數(shù)法測定醬油種曲干基孢子數(shù)，同一實驗樣品2次測定結(jié)果的相對偏差在1.51%～12.31%，平均相對偏差為7.06%，相對偏差合格率100%；采用分光光度法測定醬油種曲干基孢子數(shù)，同一實驗樣品2次測定結(jié)果的相對偏差在0%～4.02%，平均相對偏差為1.41%，相對偏差合格率100%，本法的相對偏差整體明顯低于血球計數(shù)法，相比更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確。同時，以兩種方法2次測定結(jié)果的均值作為各自測定結(jié)果，考察兩種方法間測定結(jié)果的一致性，其方法間的相對偏差在2.29%～11.27%，方法間平均相對偏差為6.32%，方法間相對偏差合格率100%。結(jié)果表明，兩種方法測定結(jié)果的相對偏差符合醬油種曲孢子數(shù)檢測控制要求，分光光度法能夠替代血球計數(shù)法用于測定醬油種曲的孢子數(shù)。

3 結(jié)論

目前，對醬油種曲孢子數(shù)測定的研究較少，一般均采用血球計數(shù)法，本實驗對比了血球計數(shù)法與分光光度法測定醬油種曲的孢子數(shù)，從實驗可發(fā)現(xiàn)，血球計數(shù)法與分光光度法測定醬油種曲的孢子數(shù)均符合醬油種曲孢子數(shù)檢測控制及方法學(xué)的要求。通過本實驗研究表明，在14～72億個/g醬油種曲濕基孢子數(shù)與吸光度線性關(guān)系良好，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定時，精密度實驗RSD為1.62%，重復(fù)性實驗RSD為1.92%，與血球計數(shù)法的相對偏差合格率為100%，該方法可靠、準(zhǔn)確穩(wěn)定。同時，本實驗采用分光光度法，直接使用處理好的孢子液測定吸光度即可，替代了血球計數(shù)法的制片與鏡檢計數(shù)操作，單個樣品計數(shù)環(huán)節(jié)的檢測時間可控制在1 min以內(nèi)完成，檢測效率較原方法提高了96.7%。由此可見，分光光度法可替代血球計數(shù)法，在生產(chǎn)中為醬油種曲孢子的計數(shù)提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確的方法，具有廣泛應(yīng)用的價值，可為其他真菌孢子的計數(shù)研究提供參考。

當(dāng)然，本實驗還有一些不足的地方，本實驗針對兩種方法測定結(jié)果的一致性判斷對比方法、樣本量等還有完善空間，未考察不同培養(yǎng)工藝、不同出發(fā)菌株所得醬油種曲線性關(guān)系是否一致等，出發(fā)菌株、培養(yǎng)時間等不同均可能會對本方法產(chǎn)生一定影響，這些問題仍需在今后實驗技術(shù)中不斷研究改進(jìn)。