維生素B12檢測方法發(fā)展現(xiàn)狀研究

王 玨

（安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051）

維生素B12是B族維生素中的一類，其和人們的健康息息相關(guān)，通常以輔酶的形式參與人體各種代謝活動，有促進(jìn)甲基形成、維持巰基還原狀態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞成熟等多種功能。如果人體缺乏維生素B12將會引起神經(jīng)紊亂、心臟病甚至是癌癥等嚴(yán)重疾病，因此維生素B12受到了人們越來越多的關(guān)注。但維生素B12在人體內(nèi)的含量很少，體外穩(wěn)定性較差，化合物組成復(fù)雜，對其進(jìn)行分析存在相當(dāng)?shù)碾y度。因此，選擇精準(zhǔn)且高效的維生素B12檢測方法也就顯得極為重要。

1 維生素B12性狀及功能

維生素B12（Vitamin B12），又名鈷胺素，是一種含鈷的咕啉類化合物的總稱，同時(shí)其也是人體內(nèi)唯一一種含有金屬元素的水溶性維生素，由Elders等人于1926年在使用肝浸膏治療惡性貧血癥時(shí)首次發(fā)現(xiàn)。維生素B12為紅色結(jié)晶體，其熔點(diǎn)較高（＞320 ℃），沒有特殊氣味，且易溶于水、乙醇、甲醇等溶液，但不溶于乙醚、丙酮等溶液。維生素B12溶于水后的水溶液呈現(xiàn)中性，且性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，但在處于強(qiáng)酸（pH＜2）或者強(qiáng)堿（pH＞9）的環(huán)境中易分解。

維生素B12是一種結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的小分子，其化學(xué)分子式為CoC63H88O14N14P，相對分子質(zhì)量為1 355.38，呈類八面體結(jié)構(gòu)。一般來講，動植物自身不具有合成維生素B12的能力，因此人類攝入的絕大部分維生素B12來源于肉類和海產(chǎn)品，而小部分的發(fā)酵食品也會含有少量的維生素B12。在自然界中，能夠生成維生素B12的主要是放線菌、細(xì)菌、米根霉菌等微生物。對于動物來講，由于其腸道內(nèi)所共生的細(xì)菌種類較多，其中諸如干酪乳桿菌等具有合成維生素B12的能力，因此在這些細(xì)菌的作用下，動物也能夠產(chǎn)生不同水平的維生素B12，以維持身體正常的代謝活動。

2 維生素B12檢測方法

2.1 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜質(zhì)譜法作為一種新興的分析檢測方法，它的出現(xiàn)為食品分析檢測技術(shù)提供了更為多元化的選擇。液相色譜-質(zhì)譜分析法將液相色譜所擁有的高效迅速以及質(zhì)譜所擁有的高靈敏度、強(qiáng)定性力等優(yōu)點(diǎn)有效結(jié)合起來，可以對多種不同的樣品開展定性以及定量化分析。施煜等[1]采用液相色譜-質(zhì)譜法對運(yùn)動飲料中維生素B12等維生素進(jìn)行了測量，樣品用水進(jìn)行超聲提取之后，采用ACQUITY HSS T3液相色譜柱分離，以濃度為0.1%的甲酸甲醇混合溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，相關(guān)系數(shù)＞0.999，回收率為90%～102.3%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法適用于對運(yùn)動飲料中所含維生素含量進(jìn)行測定。顧文等[2]采用UPLC-MS法對固體飲料中的維生素B12含量進(jìn)行測定，以醋酸為提取液，采用Strata C18固相萃取柱凈化并富集維生素B12，經(jīng)過洗脫定容之后再采用Agilent ZORBAXSB-Aq C18高效色譜柱分離，進(jìn)行定量檢測，研究結(jié)果表明采用該方法對維生素B12進(jìn)行檢測具有較高的精準(zhǔn)度和重現(xiàn)性。

2.2 微生物法

微生物法也是一種常見的維生素測定方法，主要利用維生素的特異性，在特定環(huán)境下對微生物進(jìn)行培養(yǎng)，并利用微生物的新陳代謝來對維生素進(jìn)行測定。宴濤等[3]采用微生物法對功能性飲料中的維生素B12含量進(jìn)行了研究，利用萊士曼氏乳酸桿菌生長速率與B12濃度的線性關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中B12的含量，相關(guān)系數(shù)為0.993，在0～0.1 ng，吸光度值與維生素B12含量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。韓冀等[4]采用微生物法對寵物食品中的維生素B12進(jìn)行了測定，將均質(zhì)樣品加入50 mL無菌離心管中，然后加入40 mL去離子水，在95 ℃水浴中提取30 min，快速冷卻之后，用0.22 μm無菌濾膜過濾取濾液，經(jīng)過處理后采用微生物法進(jìn)行檢測，回收率為94.0%～106.0%；試驗(yàn)結(jié)果表明，采用微生物法對寵物食品中維生素B12含量進(jìn)行測定具有靈敏度高、精準(zhǔn)度較高的優(yōu)點(diǎn)。

2.3 分光光度法

采用分光光度法檢測維生素B12主要是利用維生素B12具有水溶性的特點(diǎn)，對紫外線有較強(qiáng)的吸收作用。采用分光光度法測定維生素B12具有靈敏度較高、操作簡便以及使用成本較低的優(yōu)點(diǎn)。湯家華等[5]采用分光光度法對維生素B12中鈷的含量進(jìn)行了測定，將一定量的樣品溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，再依次向其中加入pH值為9.2的緩沖溶液2.0 mL、50 g·L-1TritonX-100 2.0 mL、0.4 g·L-15’-硝基水楊基熒光酮溶液1.0 mL，用超純水定容至刻度后，搖勻，然后在波長為546 nm處檢測試樣的吸光度。研究結(jié)果表明，表觀摩爾吸光系數(shù)為3.7×104L·mol-1·cm-1，RSD為2.2%，回收率為96%，滿足分析要求。

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法作為當(dāng)今一種重要的技術(shù)平臺，其具有高靈敏度、高分辨率以及高通量等優(yōu)點(diǎn)，使其成為檢測維生素B12時(shí)常用的一種方法。高效液相色譜法通常會采用C18色譜柱，用流動相進(jìn)行洗脫完成對維生素B12的分離，因此該方法適用于對血液或者藥品中維生素B12進(jìn)行檢測。為有效降低高效液相色譜法檢測維生素B12的檢出限，研究人員開發(fā)出了多種新型的前處理方法，提升了檢測的精準(zhǔn)度。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，液相色譜法被不斷優(yōu)化和改進(jìn)，并被廣泛應(yīng)用在了各種化合物的檢測中。何文等[6]采用高效液相色譜法對嬰幼兒乳粉中維生素B12含量進(jìn)行了測定，乳粉樣品經(jīng)過水溶解后，經(jīng)免疫親和柱凈化，進(jìn)行超聲提取、高速離心之后過濾，然后上機(jī)進(jìn)行檢測，采用流動相為甲醇溶液，色譜柱溫度為40 ℃，檢測波長為361 nm，采用外標(biāo)法對維生素B12開展了定量分析。賀習(xí)文等[7]則采用磷酸鹽和甲醇的混合液作為流動相，檢測波長設(shè)定為361 nm，對飼料中含有的維生素B12進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果顯示，該方法具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.05 μg·mL-1，具有較高的檢測準(zhǔn)確度。

2.5 原子吸收光譜法

原子吸收光譜法也是一種十分重要的維生素B12檢測方法，其主要是利用維生素B12中所含有的配位金屬原色鈷，對鈷含量進(jìn)行測定，進(jìn)行相應(yīng)的換算即可得出維生素B12的含量。用該方法來檢測維生素B12具有檢出限較低、靈敏度較高、重復(fù)性較強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于各種保健品以及嬰幼兒乳品中維生素B12含量的檢測。畢雪艷[8]采用火焰原子吸收法對維生素B12中鈷的含量進(jìn)行了測定，檢測波長設(shè)定為240.7 nm，乙炔流量為2.0 L·min-1。檢測結(jié)果表明，鈷濃度在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回收率為98.8%，該方法測定維生素B12鈷含量具有靈敏度高、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)。

2.6 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法的應(yīng)用始于1980年代末期，是一種以高壓電場作為驅(qū)動力，以毛細(xì)管作為分離通道，結(jié)合樣品中各個(gè)組分之間淌度和分配行為上的不同來實(shí)現(xiàn)分離的一種液相方法。毛細(xì)管電泳法具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于水溶性維生素的檢測。

2.7 化學(xué)發(fā)光法

從分類上來看，化學(xué)發(fā)光法屬于分子發(fā)光光譜分析法的一種，其主要是利用化學(xué)檢測體系中被測樣品濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系的原理，使用專業(yè)的儀器來對體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，進(jìn)而對被測樣品進(jìn)行分析。因此，采用化學(xué)發(fā)光法檢測食品中維生素B12是以某些特定試劑能夠與維生素B12產(chǎn)生反應(yīng)發(fā)光為基礎(chǔ)的。朱金坤等[9]建立了一種新型毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法檢測維生素B12，線性范圍為6×10-7～6×10-4mol·L-1，RSD為2.4%，回收率為97%～106%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用該方法對維生素B12進(jìn)行檢測可以得出更為精準(zhǔn)、可靠的檢測數(shù)據(jù)。

2.8 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法是一種在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上研發(fā)出的新型免疫測定技術(shù)，由瑞典學(xué)者Engvall等人于1971年首次提出，其主要原理是通過抗體和酶復(fù)合物結(jié)合，通過顯色反應(yīng)來對樣本進(jìn)行檢測。李江等[10]采用酶聯(lián)免疫吸附法對嬰幼兒配方奶粉中維生素B12含量進(jìn)行了檢測，采用60%的甲醇溶液來提取奶粉樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒標(biāo)板來包被有維生素B12的抗原，并讓其保持免疫活性，然后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)顏色變化的深淺來對維生素B12進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用該方法測定維生素B12的相關(guān)系數(shù)為99.7%，檢出限在3～243 μg·kg-1，具有較高的靈敏性和精準(zhǔn)度，且操作方法較為簡單。

3 試劑盒法與國標(biāo)法測定維生素B12的比較

鑒于維生素B12具有不穩(wěn)定性，在對樣本進(jìn)行采集、轉(zhuǎn)移和存儲過程中要特別注意環(huán)境溫度和光照環(huán)境，并依據(jù)具體的保存條件在規(guī)定時(shí)間內(nèi)對樣本進(jìn)行檢測，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)前針對維生素B12含量進(jìn)行檢測的方法多種多樣，而在實(shí)際應(yīng)用過程中較為常見的兩種方法為國標(biāo)法和試劑盒法。余文[11]采用試劑盒法對嬰幼兒乳粉以及功能飲料中維生素B12的含量進(jìn)行了快速檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過優(yōu)化的試劑盒法能夠有效縮短實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間，且操作較為簡單，將其和國標(biāo)法進(jìn)行比較，其具有精準(zhǔn)可靠、操作方便的特點(diǎn)。陳敏兒等[12]則比對了國標(biāo)法和試劑盒法測定維生素膠囊葉酸含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，國標(biāo)法和試劑盒法都具有較高的重復(fù)性，且兩種方法的相對偏差均小于4%。在精密度方面，國標(biāo)法的回收率保持在100%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2%～4%；試劑盒法的回收率則保持在78.5%左右，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差高于4%。由此可以看出采用試劑盒法檢測精準(zhǔn)度較低，但相較于國標(biāo)法，采用試劑盒法進(jìn)行檢測也有著操作步驟較為簡單、污染概率較低以及方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。因此，在實(shí)際工作過程中，應(yīng)結(jié)合具體的檢測要求來選擇最為科學(xué)的方法。

4 結(jié)語

當(dāng)今人們對于健康的關(guān)注程度越來越高，而維生素B12作為一種維持人體正常新陳代謝的重要有機(jī)化合物，必將會引起全社會的廣泛關(guān)注。雖然現(xiàn)如今針對維生素B12的檢測方法多種多樣，但每種方法都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用領(lǐng)域，因此在實(shí)際使用過程中，也應(yīng)結(jié)合具體的檢測需求選擇最為合適的檢測方法。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，維生素B12的檢測方法將會朝著更加精準(zhǔn)、穩(wěn)定、快速、高效的方向發(fā)展。