潰瘍性結腸炎患者血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表達水平及與預后相關性研究

王 飛，祝 靳，趙寶林（南京市浦口區(qū)中醫(yī)院/南京市中醫(yī)院浦口分院肛腸科，南京 211800）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）為慢性非特異性炎癥疾病，其病程較長且易反復發(fā)作，可引起腸穿孔甚至癌變，因此，早期評估UC 的病情對于改善患者的預后具有重要意義[1-2]。UC 是一種炎癥性疾病，抑制炎癥是治療UC 的一種有效方法，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在免疫應答、炎癥反應中發(fā)揮重要作用[3]。研究顯示，LncRNA 心肌梗死相關轉錄本2（long non-coding RNA myocardial infarction-related transcript 2，LncRNA Mirt2）在UC 患者血漿中下調(diào)表達，且可調(diào)節(jié)結腸上皮細胞IL-22 的表達[4]。LncRNA 干擾素γ- 反義RNA1（long non-coding RNA interferon γ-antisense RNA 1，LncRNA IFNGAS1）可促進炎癥因子的表達，在UC 中表達失調(diào)，是作為UC 的炎癥增強子[5]。LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 與UC 臨床上預后相關性尚未見報道，本研究探討LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達情況與UC 患者預后相關性，為臨床治療提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。選擇2018年12月～2021年1月南京市浦口區(qū)中醫(yī)院（南京市中醫(yī)院浦口分院）收治的193 例UC患者作為觀察對象，其中男性101 例，女性92 例，年齡32～65（47.40±6.80）歲。193 例UC 患者中緩解期85 例，活動期108 例，其中輕度43 例，中度35 例，重度30 例；根據(jù)患者預后情況分為復發(fā)組78 例和未復發(fā)組115 例。納入標準：①符合UC 診斷標準[6]；②入院前未進行相關治療；③所有患者知情并同意。排除標準：①伴有結腸狹窄、梗阻、腸道結核等腸道疾病；②并發(fā)嚴重心、肝、腎等系統(tǒng)疾?。虎鄄l(fā)直腸癌等惡性腫瘤疾病者；④自身免疫性疾病患者；⑤伴有精神疾病患者；⑥妊娠或哺乳期女性。緩解期與活動期判斷標準：采用Mayo 評分[6]評價，評分0～2 分為癥狀緩解，3～5 分為輕度活動，6～10 分為中度活動，11～12 分為重度活動。另選取同期190 例健康體檢者作為對照組，其中男性97 例，女性93 例，年齡33～68（47.80±6.50）歲。觀察組與對照組性別、年齡之間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2/t=0.063，0.588，均P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 總RNA 提取試劑（total RNA extraction reagent，TRIzol）試劑（貨號15596026，Invitrogen 公司）；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號ZY130911，澤葉生物科技有限公司）；SYBR Green 定量實時熒光定量PCR 儀（real time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒（貨號LM-0051，聯(lián)邁生物科技有限公司）；白介素-6（interleukin-6，IL-6），腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（聯(lián)邁生物科技有限公司）；ABI 7500 型熒光定量PCR 儀（ABI 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：分別采集UC 患者入院24h 內(nèi)及對照者體檢當天空腹靜脈血5ml，3 000g 離心20min，分離血清，-80℃冷凍保存。

1.3.2 血清LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 表達水平檢測：TRIzol 試劑提取總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA 后，采用qRT-PCR 實驗檢測血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1表達水平。LncRNA Mirt2 上游引物序列：5’-TCAACACT TTCCATAGGT-3’，下游引物序列：5’-ATTGTGAG GTCCAGATAG-3’；LncRNA IFNG-AS1上游引物序列：5’-GCTGATGATGGTGGCAATCT-3’，下游引物序列：5’-TTAGCAGTTGGTGGGCTTCT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAG CG-3’，下游引物序列：5’-ACCACCCTGTTGCTG TAGCCAA-3’；反應結束后，以GAPDH 為內(nèi)參采用2-ΔΔCt計算相對表達水平。

1.3.3 血清C 反應蛋白（C-reactive protein，hCRP），IL-6 和TNF-α 水平檢測：采用免疫比濁法檢測血清CRP 水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法檢測IL-6，TNF-α 表達水平，具體操作嚴格按照操作說明進行。

1.3.4 隨訪：對所有UC 患者進行為期一年的隨訪，采用門診或電話隨訪方式，每二個月隨訪一次，隨訪截止時間為2022年1月31日，隨訪終點為患者復發(fā)或隨訪結束。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，計數(shù)資料采用（n，%）表示，采用卡方檢驗；Pearson 法分析UC 患者血清LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 表達水平相關性及LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 與CRP，IL-6，TNF-α 的相關性；受試者工作特性（receiver operator characteristic curves，ROC）曲線分析血清LncRNA Mirt2 和LncRNA IFNG-AS1 對復發(fā)UC 的診斷價值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1表達水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平比較 見表1。緩解期組與活動期組UC 患者血清LncRNA Mirt2表達水平低于對照組，LncRNA IFNG-AS1 表達水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=10.064,26.235,24.745,28.629,19.473；27.847,27.488,44.632,40.715,19.998，均P＜0.001）；活動期組UC 患者血清LncRNA Mirt2表達水平低于緩解期組，LncRNA IFNG-AS1 表達水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平高于緩解期組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=16.210，12.420，14.600，15.275，16.844，均P＜0.001）。

表1 三組血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平比較（±s）

表1 三組血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達水平及CRP，IL-6，TNF-α 水平比較（±s）

項目對照組（n=190）緩解期組（n=85）活動期組（n=108）F 值P 值LncRNA Mirt21.07±0.120.92±0.100.71±0.08400.428＜0.001 LncRNA IFNG-AS11.01±0.141.63±0.252.27±0.42758.421＜0.001 CRP（mg/L）4.32±1.2713.42±4.7125.38±6.29910.667＜0.001 IL-6（pg/ml）2.87±0.788.31±2.3516.55±4.52886.585＜0.001 TNF-α（pg/ml）8.42±1.6315.38±4.29*28.94±6.37862.592＜0.001

2.2 活動期不同嚴重程度UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG AS1 表達水平比較 見表2。中、重度組UC 患者血清LncRNA Mirt2 表達水平低于輕度組，LncRNA IFNG-AS1 表達水平高于輕度組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=7.567，17.225；3.890，13.621，均P＜0.001）；重度組UC 患者血清LncRNA Mirt2 表達水平低于中度組，LncRNA IFNG-AS1 表達水平高于中度組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=6.184，5.957，均P＜0.001），

表2 活動期不同嚴重程度UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達水平比較（±s）

表2 活動期不同嚴重程度UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達水平比較（±s）

項目輕度組（n=43）中度組（n=35）重度組（n=30）F 值P 值LncRNA Mirt20.81±0.060.69±0.080.58±0.05113.038＜0.001 LncRNA IFNG-AS11.90±0.312.25±0.482.83±0.2558.739＜0.001

2.3 UC 患者血清LncRNA Mirt2 與LncRNA IFNGAS1 表達水平及與CRP，IL-6，TNF-α 相關性相關性分析顯示，UC 患者血清LncRNA Mirt2 與LncRNA IFNG-AS1 表達水平呈負相關（r=-0.540，P＜0.001）。UC 患者血清LncRNA Mirt2 表達水平與CRP，IL-6，TNF-α 呈負相關（r=-0.623，-0.605，-0.571，均P＜0.001），LncRNA IFNG-AS1表達水平與CRP，IL-6，TNF-α 呈正相關（r=0.457，0.531，0.497，均P＜0.001）。

2.4 UC患者不同預后血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達水平比較 復發(fā)組UC 患者血清LncRNA Mirt2 表達水平顯著低于未復發(fā)組（0.70±0.08 vs 0.87±0.11），LncRNA IFNG-AS1 表達水平顯著高于未復發(fā)組（2.38±0.41 vs 1.72±0.28），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.706，13.294，均P＜0.001）。

2.5 血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 對復發(fā)UC 的診斷價值 見圖1。血清LncRNA Mirt2診斷復發(fā)UC 的曲線下面積為0.850（95%CI：0.792～0.897），截斷值為0.82，敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為79.49%，78.26%，71.26%，84.91% 和78.76%。血清LncRNA IFNG-AS1 診斷復發(fā)UC 的曲線下面積為0.893（95%CI：0.841～0.933），截斷值為2.06，敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為80.77%，81.74%，75.00%，86.24%和81.35%。血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1聯(lián)合診斷復發(fā)UC 的曲線下面積為0.931（95%CI：0.886～0.963），敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和準確度分別為87.18%，86.96%，81.93%，90.91%和87.05%。

圖1 血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 對復發(fā)UC 的預測價值

3 討論

LncRNA 在調(diào)節(jié)細胞生長、炎癥反應、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮重要作用[7]。報道顯示，LncRNA 在克羅恩病、結腸癌等腸道疾病中表達水平異常，可通過促進炎癥細胞浸潤、調(diào)節(jié)結腸上皮細胞凋亡、免疫細胞功能等參與UC 的發(fā)生發(fā)展[8]。LncRNA Mirt2 可調(diào)節(jié)巨噬細胞極化，抑制Lys63(K63)-連接腫瘤壞死因子受體相關因子6 的泛素化，從而抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路的激活，抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生[9]。LncRNA IFNG-AS1 可調(diào)控促炎癥因子的生成，與多種炎癥性疾病有關[10]。在冠心病(coronary heart disease，CAD)患者血漿LncRNA IFNG-AS1 表達水平升高，與疾病嚴重程度增加和炎癥因子水平呈正相關[11]。研究顯示，UC 患者血漿中LncRNA Mirt2 表達水平降低，LncRNA IFNGAS1 表達水平升高，二者對UC 有一定診斷價值，體外研究顯示，LncRNA Mirt2，LncRNA IFNGAS1 均參與調(diào)控結腸上皮凋亡[12]。

本研究結果顯示，UC 患者血清LncRNA Mirt2表達水平顯著降低，LncRNA IFNG-AS1 表達水平顯著升高，與報道結果類似，且LncRNA Mirt2 表達水平隨UC 病情加重而降低，LncRNA IFNG-AS1表達水平隨UC 病情加重而升高，提示LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達失調(diào)與UC 的發(fā)生發(fā)展有關，這可能與LncRNA Mirt2 發(fā)揮抗炎作用而LncRNA IFNG-AS1 發(fā)揮促炎作用有關，研究顯示，LncRNA Mirt2 可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶信號通路抑制miR-101 表達，抑制膿毒癥大鼠心肌炎癥反應，從而改善心臟結構和功能[13]。另有研究顯示，膿毒癥患者血清LncRNA IFNG-AS1表達升高，與疾病嚴重程度及血清CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-8 水平呈正相關[14]。因此推測LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 在UC 的作用可能是LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 通過影響結腸上皮增殖與凋亡增殖、炎癥反應而在UC 的發(fā)展進程中發(fā)揮作用。

UC 的發(fā)病與遺傳、感染、免疫等多種因素有關，在外界因素的刺激下，觸發(fā)機體的免疫反應和炎癥發(fā)生。報道顯示，UC 患者血清IL-6，IL-15，CRP水平升高與患者預后相關[15]。CRP 為炎性標志物，IL-6，TNF-α 為促炎因子[16]，本研究顯示，UC 患者炎癥因子水平升高，且與患者病情嚴重程度有關，表明UC 患者病情越嚴重，機體炎性水平越高。相關性分析顯示，UC 患者血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 表達水平與炎癥因子均具有相關性，提示LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1水平可用于評估UC 病情嚴重程度及機體的炎癥反應狀態(tài)。本研究還顯示，UC 患者血清LncRNA Mirt2 與LncRNA IFNG-AS1 表達水平呈負相關，提示LncRNA Mirt2 的抗炎作用和LncRNA IFNGAS1 促炎作用的失衡促進UC 的炎性進展。報道顯示，UC 的發(fā)生與Th1/Th2 細胞免疫失衡有關[17]，而LncRNA IFNG-AS1 的過表達可上調(diào)Th1 炎癥因子表達，下調(diào)Th2 抗炎因子表達[18]。而LncRNA Mirt2 可抑制NF-κB 和MAPK 通路的激活抑制炎癥反應，因此LncRNA Mirt2 表達水平降低，抗炎作用減弱，而LncRNA IFNG-AS1 表達水平升高，促炎作用增強，二者可能共同參與調(diào)控UC 的炎癥反應，加重腸黏膜組織損傷，引發(fā)腸黏膜屏障功能障礙。

本研究還顯示，復發(fā)組UC 患者血清LncRNA Mirt2 表達水平顯著低于未復發(fā)組，LncRNA IFNGAS1 表達水平顯著高于未復發(fā)組，提示LncRNA IFNG-AS1 可能作為UC 患者的預后標志物。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNGAS1 聯(lián)合對于復發(fā)UC 有一定診斷價值，提示血清LncRNA Mirt2，LncRNA IFNG-AS1 水平聯(lián)合檢測對于預測UC 患者預后有一定價值，有一定臨床應用意義。本研究納入樣本量較少為本研究不足之處，其臨床應用仍需擴大樣本量做更深入的研究。

綜上所述，UC 患者血清LncRNA Mirt2 表達水平降低，LncRNA IFNG-AS1 表達水平升高，與炎癥水平和患者預后有關，可作為反映UC 患者病情與預后的標志物。