2型糖尿病腎病患者血清代謝組學(xué)分析構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型研究

陳筱濤，劉 韻，龍碧瑩，郭皖北（湘南學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南郴州 423000）

2 型糖尿病腎?。╰ype 2 diabetic nephropathy,T2DN）在世界范圍內(nèi)較為常見，臨床特點為蛋白尿、水腫、高血壓等，有學(xué)者認(rèn)為[1]，T2DN 常與糖尿病微血管病變密切相關(guān)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后情況，因此準(zhǔn)確的判斷患者預(yù)后水平尤為重要[2-4]。代謝組學(xué)具有高通量、操作簡便、定量分析的優(yōu)點，可對疾病進(jìn)行早期診斷及機(jī)制探討，是目前應(yīng)用最為廣泛的醫(yī)學(xué)技術(shù)之一[5-7]。由于患者發(fā)生低水平慢性炎癥可導(dǎo)致胰島素抵抗、T2DN 及其他并發(fā)癥，依賴代謝組學(xué)技術(shù)可監(jiān)測機(jī)體內(nèi)部已經(jīng)發(fā)生的炎癥代謝產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)疾病早期敏感生物標(biāo)志物、判斷疾病預(yù)后[8]。本文將統(tǒng)計學(xué)模型與代謝組學(xué)相結(jié)合探究T2DN 患者預(yù)后情況，采用數(shù)學(xué)模型公式和代謝組學(xué)參與研究，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式，為患者的早期預(yù)后提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年9月～2017年9月于湘南學(xué)院附屬醫(yī)院接受治療的282 例T2DN 患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲；符合T2DN診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除肝炎、肝硬化、腎臟嚴(yán)重器質(zhì)性病變患者；②尿路感染；③藥物過敏史；⑤貧血、重度肥胖等患者；⑤精神病史；預(yù)后觀察期內(nèi)，以患者死亡為研究終點，隨訪時間由2017年10月起始，隨訪時間50 個月。按照本研究中預(yù)后情況的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為預(yù)后良好組（n=199）和預(yù)后不良組（n=83）。預(yù)后良好組：年齡45～72（50.67±12.85）歲；男性103 例，女性96 例；平均病程7.55±2.34年；體溫36.11±1.02℃；發(fā)熱2 例，疼痛5 例，腦卒中史2 例，高血壓史37 例，藥物過敏史26 例，吸煙史18 例，飲酒史106 例，貧血38 例，心力衰竭3 例，呼吸機(jī)使用2 例，抗生素使用史136 例。預(yù)后不良組：年齡45～73（51.03±11.29）歲；男性44 例，女性39例；平均病程7.06±2.25年；發(fā)熱1 例，疼痛2 例，腦卒中史1 例，高血壓史18 例，藥物過敏史14 例，吸煙史8 例，飲酒史52 例，貧血20 例，心力衰竭1 例，呼吸機(jī)使用1 例，抗生素使用史66 例。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

T2DN 預(yù)后不良定義：①腎小球濾過率下降（腎小球濾過率分級下降或基線下降＞25%）；②血肌酐(Scr)≥基線Scr 的2 倍，本研究中出現(xiàn)以上情況即為T2DN 預(yù)后不良。

1.2 儀器與試劑 貝克曼庫爾特-AU5800 全自動生化分析儀[貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司]。Waters UPLC 超高效液相色譜系統(tǒng)（沃特世科技有限公司，型號：Waters ACQUITY UPLC 系統(tǒng)）。乙腈（生產(chǎn)廠家：德國CNW 科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 觀察指標(biāo)：記錄患者一般資料，包括癥狀體征以及實驗室檢査等臨床信息采集。其中一般情況主要包括年齡、性別、體重指數(shù)、血壓、病程、既往史等。記錄實驗室指標(biāo)，包括血糖項目：空腹血糖（fasting blood sugar,FBG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbAlc）；血脂項目：三酰甘油（triacylglycerol,TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白- 膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白-膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）；腎功能項目：血尿酸（uric acid,UA）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血肌酐（serum creatinine,Scr）。

1.3.2 代謝組學(xué)分析：患者空腹抽取靜脈血5ml，以3 000r/min 的轉(zhuǎn)速離心20 min 后分離血清，置于-80℃中；待測時，溫度升至4℃中，振動混合均勻，取200μl 加入500μl 乙腈中，渦旋40min，4℃下12 000 r/min 離心20 min，取上清液90 μl 于96孔接收板中，采用Waters UPLC 超高效液相色譜系統(tǒng)，配備自動進(jìn)樣分析[10]。應(yīng)用Markieview 軟件，將相關(guān)積分值進(jìn)行中心化和比例換算，同時進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial leastsquares discrimination analysis,OPLS-DA)尋找出特征差異性代謝物。OPLS-DA 樣品分布得分圖用于展示不同組間差異。根據(jù)多元統(tǒng)計分析中變量的載荷大小，篩查出組間具有顯著性差異的化合物作為潛在生物標(biāo)志物，再根據(jù)質(zhì)譜同位素匹配結(jié)果和數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果及對照品及串聯(lián)質(zhì)譜的鑒別結(jié)果，對潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗進(jìn)行比較；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗進(jìn)行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用向前逐步法明確最終納入預(yù)測模型的變量，根據(jù)各變量對應(yīng)的偏回歸系數(shù)（β）構(gòu)建方程，建立T2DN 患者預(yù)后預(yù)測模型。利用Hosmer-Lemeshow檢驗和受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve）評價預(yù)測模型的擬合優(yōu)度以及預(yù)測能力。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)后組間實驗室指標(biāo)比較 見表1。實驗室指標(biāo)結(jié)果顯示，預(yù)后不良組的FBG，BUN，UA，TG，HbAlc 高于預(yù)后良好組，預(yù)后不良組的LDL-C，HDL-C 低于預(yù)后良好組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；Scr，TC 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 實驗室指標(biāo)比較（±s）

表1 實驗室指標(biāo)比較（±s）

項目預(yù)后良好組（n=199）預(yù)后不良組（n=83）t 值P 值FBG（mmol/L）5.03±0.697.96±1.6710.9980.000 HbAlc（%）5.96±2.578.01±2.666.0420.000 BUN（mol/L）4.51±0.916.31±0.889.6440.000 UA（μmol/L） 331.21±81.36 411.25±79.61 4.7960.000 Scr（μmol/L） 71.65±15.29 70.96±15.440.2150.415 LDL-C（mmol/L） 2.60±0.212.53±0.191.6760.048 HDL-C（mmol/L） 1.14±0.120.95±0.117.9160.000 TG（mmol/L）1.75±0.632.18±0.334.1010.000 TC（mmol/L）5.06±1.314.98±1.220.3030.381

2.2 代謝組學(xué)研究結(jié)果 OLPS-DA 分析中的值越大對分組的貢獻(xiàn)也越大，一般認(rèn)為VIP 值＞1 具有統(tǒng)計學(xué)意義，這些成分可被認(rèn)為是干擾正常生理代謝的潛在生物標(biāo)記物，再結(jié)合t檢驗，篩查出組間具有顯著性差異（P＜0.05）的化合物。OLPS-DA差異圖結(jié)果顯示，預(yù)后良好組和預(yù)后不良組的代謝狀態(tài)可明顯區(qū)分，見圖1。

圖1 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組代謝狀態(tài)OLPS-DA 差異圖

2.3 潛在標(biāo)志物測定結(jié)果及相關(guān)代謝途徑 見表2。鑒定出差異性代謝產(chǎn)物，與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組上調(diào)的代謝產(chǎn)物有溶血磷脂酰膽堿，谷氨酰胺-精氨酸，半乳糖羥賴氨酸和鵝去氧膽酸；下調(diào)的代謝產(chǎn)物有溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、鞘磷脂、心磷脂、二酰甘油、TG，苯丙胺酰-丙氨酸、神經(jīng)節(jié)苷脂，透明質(zhì)酸和磷酸二氫丙酮，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），以上代謝產(chǎn)物途徑有脂類，氨基酸，糖類代謝。

表2 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組比較差異標(biāo)志物測定結(jié)果

2.4 生存曲線分析 T2DN 患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析中，對282 例患者以納入研究后至研究終點的時間為生存時間，以進(jìn)入研究終點事件與否為因變量，比較預(yù)后良好組和預(yù)后不良組的生存差異，得出生存曲線，見圖2。中位生存時間預(yù)后不良組為19 個月，預(yù)后良好組為25 個月。

圖2 T2DN 患者預(yù)后的生存曲線

2.5 基于代謝組學(xué)分析構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型對T2DN患者預(yù)后的ROC 曲線及一致性評價 根據(jù)潛在標(biāo)志物測定結(jié)果構(gòu)建T2DN 患者預(yù)后水平的風(fēng)險預(yù)測模型，P 為模型預(yù)測概率，取值0～1。建立的預(yù)測模型如下：Logit(P) = -5.319 + 0.172(溶血磷脂酰乙醇胺) + 0.669(磷脂酰乙醇胺) +0.624(溶血磷脂酰膽堿) + 1.149(磷脂酰膽堿) + 0.841(磷脂酰甘油) + 0.271(鞘磷脂) + 0.744(心磷脂)+0.102(二酰甘油) + 0.667(TG) +0.676(谷氨酰胺-精氨酸)+ 1.067(半乳糖羥賴氨酸) + 0.802(苯丙胺酰-丙氨酸) + 0.203(鵝去氧膽酸) + 0.711(神經(jīng)節(jié)苷脂) +0.034(透明質(zhì)酸) + 0.494(磷酸二氫丙酮)。

根據(jù)預(yù)測概率P 與T2DN 患者預(yù)后水平的ROC曲線，見圖3。曲線下面積AUC 為0.853（95%CI：0.759～0.909，P＜0.001），敏感度、特異度和約登指數(shù)分別為85.26%，82.84%和0.681，約登指數(shù)衡量了模型預(yù)測的真實性，表明該模型預(yù)測T2DN 患者預(yù)后的水平較高；校準(zhǔn)度評價圖線結(jié)果顯示，校準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果無明顯偏倚，一致性較好。

圖3 基于代謝組學(xué)分析構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型對T2DM 患者預(yù)后的ROC 曲線及一致性評價

3 討論

T2DN 在患者治療后常出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥，預(yù)后效果不佳的情況時有發(fā)生，且無明顯癥狀而不易被察覺[12]。據(jù)調(diào)查[13]，目前此病發(fā)病年齡在40歲以上，但近年來，發(fā)病年齡有年輕化趨勢，嚴(yán)重危害人類健康，提出一種能夠及時預(yù)測患者預(yù)后情況的醫(yī)學(xué)技術(shù)尤為重要。另有研究表明[12]，T2DN可能導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)病變、心腦血管疾病等病癥，最終影響患者預(yù)后水平[13]?；颊咴趯嶋H生活中，很有可能從蛋白尿的出現(xiàn)到腎功能嚴(yán)重惡化，病程間隔時間較長，目前現(xiàn)有的檢測技術(shù)不能及時檢測患者病情的惡化程度，從而使患者錯過最佳治療時機(jī)，而病情如果長期控制不當(dāng)，最后發(fā)展為尿毒癥。代謝組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為預(yù)測患者預(yù)后提供了新的思路，此項技術(shù)涉及領(lǐng)域廣泛，在細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)等領(lǐng)域均有涉及[14]。其優(yōu)點在于可定性、定量地鑒定樣本的差異代謝物，通過差異代謝物反映疾病預(yù)后等關(guān)鍵信息，為臨床提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持[15-16]。另外，將T2DN 和代謝組學(xué)分析結(jié)合預(yù)測患者預(yù)后的情況，通過比較不同代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰，了解不同化合物的結(jié)構(gòu)，找出相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，從而以此建立一套完備且能夠用于此類疾病預(yù)測的分析方法。目前關(guān)于此類研究鮮有報道，對此進(jìn)行更深入研究具有一定的可行性。而對于代謝產(chǎn)物來說，相應(yīng)的質(zhì)譜峰和代謝途徑均可以通過代謝組學(xué)的方式加以了解，并結(jié)合使用可獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。研究認(rèn)為[17]，T2DN 的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到糖、脂、氨基酸等多種代謝方式、且基因易感化，患者預(yù)后水平判別較為困難，代謝組學(xué)以其高通量、覆蓋面廣的優(yōu)勢，成功解決了這一難題[15-16]。具體表現(xiàn)為基因易感化，預(yù)后水平判別難的問題均得到有效解決，在實際的操作過程中，差異性代謝物的各變量間相關(guān)性較高，而目前運用傳統(tǒng)的單變量分析挖掘數(shù)據(jù)內(nèi)潛在的信息又不能達(dá)到準(zhǔn)確和快速的要求。

本研究基于代謝組學(xué)，運用多元統(tǒng)計分析方法，可較大程度保留原始信息的基礎(chǔ)上將高維復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行對研究對象的代謝譜特點進(jìn)行歸納和總結(jié)，并選擇P值小于0.05 與VIP 值大于1 作為常見的差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型對T2DN患者的預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測。此前，基于代謝組學(xué)研究，學(xué)術(shù)界亦有相關(guān)報道，趙黎君等[18]提出代謝組學(xué)的高通量、覆蓋面廣的優(yōu)勢，適合類似于糖尿病腎病的研究，可能與患者機(jī)體糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。而本研究中通過代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)兩組的代謝狀態(tài)可明顯區(qū)分，代謝產(chǎn)物途徑有脂類、氨基酸、糖類代謝，證實了糖尿病腎病與機(jī)體內(nèi)部代謝紊亂有關(guān)。同時，王美杰等[19]指出，患者內(nèi)部存在亞油酸等氨基酸代謝發(fā)生改變的可能，而本研究中發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺-精氨酸、半乳糖羥賴氨酸均為上調(diào)趨勢產(chǎn)物，說明血清支鏈氨基酸水平的升高能預(yù)測胰島素抵抗水平，氨基酸代謝水平異常，胰島素抵抗嚴(yán)重，上述指標(biāo)均可對患者的預(yù)后加以預(yù)測，與王美杰等[19]研究存在相似性。T2DN主要引起微血管病癥，代謝組學(xué)的引入目的為結(jié)合使用臨床信息獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，有效證實糖尿病腎病與機(jī)體內(nèi)部代謝間的關(guān)聯(lián)，本研究在代謝組學(xué)保留原始信息的基礎(chǔ)上將高維復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行對研究對象的代謝譜特點進(jìn)行歸納和總結(jié)，篩選出差異性代謝產(chǎn)物，相應(yīng)氨基酸上調(diào)和下降趨勢說明機(jī)體內(nèi)部代謝水平異常，能夠?qū)颊叩念A(yù)后水平進(jìn)行有效預(yù)測，及時在治療方法層面做出調(diào)整。本研究鑒定出差異性代謝產(chǎn)物中，上調(diào)的代謝產(chǎn)物中，溶血磷脂酰膽堿在體內(nèi)是氧化型低密度脂蛋白的主要活性成分，參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)，參與溶血機(jī)制的調(diào)節(jié)，而溶血磷脂酰膽堿上調(diào)則表明T2DN 患者血脂調(diào)節(jié)機(jī)制出現(xiàn)異常；谷氨酰胺-精氨酸上調(diào)，由于精氨酸是谷氨酰胺的前體，機(jī)體內(nèi)精氨酸可合成谷氨酰胺而更利于人體吸收，T2DN 患者的谷氨酰胺-精氨酸上調(diào)說明患者營養(yǎng)物質(zhì)缺乏較多，導(dǎo)致精氨酸可合成谷氨酰胺過程加快以補(bǔ)充機(jī)內(nèi)因代謝水平異常而缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)；半乳糖羥賴氨酸是由羥基賴氨酸翻譯后糖基化產(chǎn)生的骨膠原蛋白，在骨吸收過程中釋放，并在代謝性骨丟失中升高，半乳糖羥賴氨酸上調(diào)說明代謝性骨丟失過程加強(qiáng)，骨蛋白代謝活動增多，有可能出現(xiàn)代謝水平異常等癥狀。下調(diào)的代謝產(chǎn)物中，溶血磷脂酰乙醇胺在腦組織中居多，與溶血磷脂酰膽堿類似，但是不同的是溶血磷脂酰乙醇胺下調(diào)則表示β位脂肪酰基水解脫落異常，從而出現(xiàn)T2DN 的血脂水平下降或上升；磷脂酰膽堿是細(xì)胞膜、肺泡表面活性物質(zhì)、脂蛋白和膽汁的重要成分，對維持肝和腦功能、脂質(zhì)代謝和運輸、細(xì)胞膜信號傳遞、細(xì)胞組成和修復(fù)都有至關(guān)重要的作用。磷脂酰甘油是構(gòu)成生物膜的主要物質(zhì)，且是膽汁和膜表面活性物質(zhì)的主要成分之一，T2DN 患者血脂水平異常很可能由于細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)阻礙所致，表現(xiàn)在代謝組學(xué)上磷脂酰甘油水平下調(diào)。鞘磷脂、心磷脂、二酰甘油、TG，神經(jīng)節(jié)苷脂等脂類物質(zhì)均是主要存在于腦、骨髓、神經(jīng)組織,以及心、肝、腎等器官中的脂質(zhì)代謝物，其水平下調(diào)可能由于代謝活動過程中脂質(zhì)水解過程加強(qiáng)，溶酶體中神經(jīng)磷脂酶催化的水解產(chǎn)物增多，從而使得各種產(chǎn)物在組織內(nèi)嚴(yán)重堆積，可造成T2DN 的一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重者影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，甚至危及生命。苯丙胺酰-丙氨酸、透明質(zhì)酸、磷酸二氫丙酮等物質(zhì)均參與機(jī)體內(nèi)部糖酵解的過程，準(zhǔn)確聯(lián)絡(luò)甘油和葡萄糖的間體化學(xué)物質(zhì)，T2DN 患者由于胰島素抵抗嚴(yán)重，糖酵解途徑放緩，導(dǎo)致苯丙胺酰-丙氨酸、透明質(zhì)酸、磷酸二氫丙酮等中間產(chǎn)物消耗速率加快，表現(xiàn)在代謝組學(xué)上為下調(diào)趨勢。另外，建立預(yù)測模型的約登指數(shù)衡量了模型預(yù)測的真實性，且校準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果無明顯偏倚，一致性評價結(jié)果良好。本研究的局限性在于對代謝物進(jìn)行定量分析，深層機(jī)理和生化的理解復(fù)雜，在確定代謝物結(jié)構(gòu)和功能的過程中，識別力較為分散。

綜上所述，基于代謝組學(xué)分析構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型對預(yù)測T2DN 患者預(yù)后的情況可明顯區(qū)分，本研究提出的具有差異性的代謝物均對患者預(yù)后有預(yù)測價值。