精液樣本保存方式對精子DNA碎片率檢測影響的實(shí)驗(yàn)研究

黃 誠，陸碧玉，代元平，黃李霜，楊金鈴，黃麗華，陳大宇，蔡 稔，嚴(yán)提珍（柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科/柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，柳州市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545001）

精子DNA 是男性將遺傳物質(zhì)傳遞給子代的載體，許多研究表明精子DNA 損傷會影響自然受精、胚胎發(fā)育以及輔助生殖的妊娠結(jié)局，并與男性不孕不育和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)。當(dāng)前業(yè)界廣泛認(rèn)為精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）可以較好反映整體精子DNA 受損程度，現(xiàn)已列為衡量精子質(zhì)量的一項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)[1-3]。相對于常規(guī)的活力和生化檢測，DFI 更側(cè)重于反映精子遺傳物質(zhì)的健康度。如今用于檢測精子DNA 完整性的方法有很多，其中應(yīng)用最普遍的是精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法（sperm chromatin structure analysis，SCSA），并且該方法可以在流式細(xì)胞儀上運(yùn)用。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytomtry，F(xiàn)CM）是分析分類單個細(xì)胞組群最為高效準(zhǔn)確的技術(shù)，用流式細(xì)胞儀檢測精子DFI可以在短時間內(nèi)檢測大量精子，將不同熒光信號的精子進(jìn)行分類即可算出DFI，結(jié)果更為客觀準(zhǔn)確[4]。但在整個實(shí)驗(yàn)流程中依然存在可能會影響檢測結(jié)果的因素，當(dāng)精液樣本留存時間過長可能出現(xiàn)精子核物質(zhì)降解、微生物滋生、精子形態(tài)改變甚至破裂等情況[5-6]。所以在實(shí)際工作中精子DFI 檢測的樣本時效不容忽視，本實(shí)驗(yàn)將研究樣本新鮮度對精子DFI 檢測結(jié)果的影響，探討在實(shí)際工作中該如何保存樣本。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選擇2020年12月期間柳州市婦幼保健院生殖中心男科門診日常送檢的精液樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過精液常規(guī)結(jié)果排除無精少精癥患者；②排除樣本液化不全患者。最終選取38份樣本（樣本提供者年齡26～52 歲）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（文件號：科研-2018-004），患者知情同意。

1.2 儀器與試劑 本實(shí)驗(yàn)使用試劑為深圳華康生產(chǎn)的吖啶橙染色液，樣本檢測使用美國BD FACSVia流式細(xì)胞儀。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組：每個樣本充分液化后混勻分成4等份，分為A，B，C，D 共4 組：A 組當(dāng)即檢測，然后放置室溫保存，每2h 再測1 次，共測得A1，A2，A3 三組數(shù)據(jù)；B 組放置2～8℃冰箱保存，每24h 檢測1 次，連測3 天,共獲得B1，B2，B3三組數(shù)據(jù)；C 組放-20℃冰箱冷凍，每周解凍測1 次，測完放回冰箱復(fù)凍，連測4 周，共獲得C1，C2，C3，C4 四組數(shù)據(jù)；D 組放置-20℃冰箱冷凍，30天后解凍檢測1 次，獲得D1 組數(shù)據(jù)。

1.3.2 檢測方法：按SCSA 法對精子細(xì)胞進(jìn)行染色，每個樣本采用中等流速計數(shù)10 000 個精子。正常精子由于DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)完整其熒光信號以530nm為主，而DNA 異常精子由于存在單鏈片段而攜帶640nm 熒光信號會偏離正常群體，最后統(tǒng)計異常精子占總精子的比例即為精子DFI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件分析，將新鮮樣本當(dāng)即檢測組（A1 組）DFI 結(jié)果與其他組的檢測結(jié)果分別進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，驗(yàn)證樣本在不同條件保存后的結(jié)果變化，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測組與不同保存方式組DFI 水平比較 結(jié)果見表1。將新鮮樣本當(dāng)即檢測組(A1 組)作為對照組，與其他組DFI 檢測結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，A1 組DFI 與A2 組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與A3 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對比結(jié)果顯示新鮮樣本在室溫保存下2h 內(nèi)檢測結(jié)果比較穩(wěn)定，放置4h 后檢測結(jié)果升高，A1 組與B1，B2，B3 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）；對比結(jié)果顯示2～8℃不能保持精子DNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。A1 組與C1，C2，C3，C4 和D1 組的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），對比結(jié)果顯示-20℃冰凍可使樣本穩(wěn)定長達(dá)一個月，且期間樣本經(jīng)過反復(fù)凍融檢測結(jié)果也無明顯波動。

3 討論

精子是以極小的體積將遺傳物質(zhì)和有限能量高度整合的生殖細(xì)胞。精核表面白的魚精蛋白（protamine，HP）可形成大量二硫鍵使精子染色體高度壓縮，從而在一定程度上保護(hù)DNA 免受傷害，使精子對各種外界環(huán)境因素有較強(qiáng)的抵抗力[7-8]。精子離體后隨著時間的推移，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會由于表面蛋白的降解發(fā)生松散，對于本實(shí)驗(yàn)的DNA 完整性檢測會造成一定干擾[9]。此外流式細(xì)胞儀主要用于檢測單細(xì)胞懸液，要求精子形態(tài)必須保持完好，若樣本不新鮮精子細(xì)胞可能發(fā)生腫脹、破裂或者微生物滋生等也會影響儀器的信號收集[10-11]。

在實(shí)際工作中，實(shí)驗(yàn)室不一定能做到在收到精液樣本就當(dāng)即檢測?，F(xiàn)實(shí)情況往往是患者一次取精要做多種檢測項(xiàng)目，精液常規(guī)項(xiàng)目需要優(yōu)先檢測，其他的生化、DFI，病原體等檢測可能會留存一段時間后再集中檢測。而有些機(jī)構(gòu)甚至是外送檢測。如果不對精液樣本進(jìn)行妥善保存會對檢測結(jié)果有很大影響。通常保存細(xì)胞樣本需要用到-80℃冰柜或者液氮，還要配合凍干保護(hù)劑，這對實(shí)驗(yàn)室場地設(shè)備和人員操作有較高要求[12]。細(xì)胞經(jīng)過-20℃冰凍會形成冰晶對內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機(jī)械損傷，反復(fù)凍融后容易發(fā)生破裂[13]。然而精液由于其精漿蛋白膠體成分影響，直接放置-20℃冰凍再復(fù)融未見精子細(xì)胞有明顯變化[14]。本研究中用流式細(xì)胞儀檢測-20℃保存后的樣本依然可以收集到精子細(xì)胞，且DFI 檢測值與新鮮原液相差無異，說明精子胞體和DNA結(jié)構(gòu)沒有因?yàn)閮鋈诙黠@破壞。與一些類似研究情況相符[15]。所以如果只為保障精子DFI 檢測準(zhǔn)確度，用一般冰箱-20℃冷凍即可有效保存精液樣本。同時也可考慮分裝個別樣本長期冰凍再分次檢測來作為該項(xiàng)目的日常質(zhì)控對照品。若條件允許，還可以進(jìn)一步研究-80℃冰柜直接冷凍是否能更長時間保持樣本穩(wěn)定。

綜上所述，為保障精子DFI 檢測結(jié)果的可靠性，精液樣本應(yīng)在采集后2h 內(nèi)完成檢測，樣本在室溫或2～8℃放置時間過長會使檢測結(jié)果偏高，若需較長時間保存建議及時將新鮮樣本放-20℃冰凍保存，時長可達(dá)一個月。