臨床患者血培養(yǎng)分離出卡明斯假谷氨酸桿菌的全基因組測序及基因功能分析

許 楠，楊旭東，田 瑩，劉澤世，薛 麗，高 寧，耿 燕（．西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 70004；.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，西安 7006）

卡明斯假谷氨酸桿菌（Pseudoglutamicibacter cumminsii）是一種需氧、過氧化氫酶陽性的革蘭陽性桿菌，其屬于球桿菌屬，主要分布于土壤中（Comn H J and Dimmick 1947）[1]。卡明斯假谷氨酸桿菌較少感染人類，以往從患者體內(nèi)分離出的卡明斯假谷氨酸桿菌主要來自尿液和皮膚[2]，其他組織樣本中尚未分離出。卡明斯假谷氨酸桿菌菌落直徑通常為2～3 mm，具有濕潤、光滑、灰色不透明等特點(diǎn)，血平板上生長無溶血環(huán)。近年來第三代基因組測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物基因組的分析，但目前尚無卡明斯假谷氨酸桿菌的基因組研究報道。與傳統(tǒng)及質(zhì)譜法相比，全基因組測序不僅可鑒定微生物種類，而且可提供其代謝特點(diǎn)、致病基因以及耐藥基因等信息，可為抗感染治療提供更有價值的指導(dǎo)意見。本研究對一株從腹膜間皮瘤患者血液中分離出來的卡明斯假谷氨酸桿菌進(jìn)行了全基因組測序及序列分析，以了解卡明斯假谷氨酸桿菌的代謝特點(diǎn)和致病性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 患者男性，36 歲，因3月前無明顯誘因出現(xiàn)乏力，加重7 天，體重減輕、下腹痛、以及體溫升高等，于2018年5月1日入西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受治療。入院前行腹部CT 及腹部彩超，提示腹腔積液、下腹及右側(cè)腹部混合性包塊。后對腹膜腫物穿刺取樣進(jìn)行活檢，確診腹膜間皮瘤。予以培美曲塞+卡鉑方案化療，化療2 周期。由于患者體溫升高，最高達(dá)39.5℃，血細(xì)胞檢測：WBC 42.89×109/L，N% 91.90%。注射用美洛西林鈉/舒巴坦鈉抗感染治療8 天后復(fù)查血細(xì)胞檢測：WBC 26.97×109/L,N% 90.10%。改用注射用亞胺培南/西司他丁鈉藥物抗感染治療。同時進(jìn)行2 次血培養(yǎng)檢測（2018年8月2日和8月15日）。

1.2 儀器與試劑 BD BACTEC FX 自動血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶[碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司]；梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀，梅里埃MALDI-TOF MS 質(zhì)譜儀（法國梅里埃公司），細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生物公司），美吉生物公司進(jìn)行測序分析的配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)：血培養(yǎng)瓶放置于自動血培養(yǎng)儀中孵育，報警陽性后立即轉(zhuǎn)種血平板，于37℃溫箱中培養(yǎng)24h 后，取單個菌落涂片后進(jìn)行革蘭染色和光鏡下觀察。梅里埃VITEK 2 Compact 和梅里埃MALDI-TOF MS 質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，具體操作嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)歐洲抗生素敏感性測試委員會（EUCAST）2021中的棒狀桿菌折點(diǎn)作為解釋參考。

1.3.2 基因組DNA 提?。簭幕颊哐簶?biāo)本中分離出的卡明斯假谷氨酸桿菌，在LB 培養(yǎng)液中通過30℃ 200r/min 搖菌12 h，然后8 000r/min 離心2min 收集菌體。應(yīng)用天根生物公司的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，通過在280nm 波長處測定DNA 樣品的A值來計算樣品的濃度及純度。隨后把DNA 樣品送往美吉生物公司進(jìn)行測序分析。

1.3.3 基因組測序和組裝：應(yīng)用二代測序平臺Illumina Hiseq×10 對質(zhì)檢合格的細(xì)菌DNA 樣品進(jìn)行de novo 基因組測序。主要步驟是構(gòu)建～400bp的片段并進(jìn)行PE150 雙端測序，其中單端測序讀長150bp，每個樣品提供不低于基因組100×覆蓋深度的原始測序數(shù)據(jù)量（raw data），通過組裝得到多條基因組scaffold。應(yīng)用短序列組裝軟件SOAPdenovo2 并根據(jù)不同的Kmer 參數(shù)拼接測序后獲得的序列，選擇最優(yōu)的contigs 組裝結(jié)果。依據(jù)reads 與contig 的對比結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化組裝結(jié)果，形成scaffolds。最后，應(yīng)用unicycler 軟件組裝出細(xì)菌的基因組，并用pilonjin 軟件進(jìn)行序列校正。通過位于序列兩端的overlap 將序列環(huán)化，從而獲得完整的卡明斯假谷氨酸桿菌染色體序列。

1.3.4 基因組組分分析：應(yīng)用Glimmer 軟件預(yù)測拼接完成的基因組構(gòu)成。應(yīng)用tRNAscan-SE v2.0 軟件預(yù)測基因組中tRNA 基因的序列及其編碼的tRNA結(jié)構(gòu)信息。應(yīng)用 Barrnap 軟件預(yù)測基因組中包含的rRNA 基因序列結(jié)構(gòu)及基因定位。

1.3.5 基因功能注釋及次級產(chǎn)物基因簇分析：將卡明斯假谷氨酸桿菌菌株的蛋白序列與6 大數(shù)據(jù)庫（NR，Swiss-Prot，Pfam，COG，GO 和KEGG）中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，對預(yù)測的基因進(jìn)行功能注釋。另外，由于次級代謝產(chǎn)物一般由多基因控制，其編碼基因通常在基因組中成簇存在，我們應(yīng)用antismash 軟件對樣本的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離、鑒定及藥敏結(jié)果 血培養(yǎng)需氧瓶在自動血培養(yǎng)儀中孵育20 h 后陽性報警，轉(zhuǎn)種血平板，于37℃溫箱中培養(yǎng)24h 后，取單個灰白色、不透明、表面光滑和無溶血環(huán)的圓形菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡下可見革蘭陽性桿菌，也可觀察到陰性桿菌，見圖1A，B。梅里埃VITEK 2 Compact 鑒定不出結(jié)果，后經(jīng)質(zhì)譜鑒定為卡明斯假谷氨酸桿菌。

圖1 卡明斯假谷氨酸桿菌血平板及染色

分離菌株對檢測藥物的MIC 分別為：亞胺培南0.004 8mg/L，利奈唑胺0.25mg/L，利福平0.008mg/L，四環(huán)素0.38mg/L，萬古霉素0.25mg/L，環(huán)丙沙星0.5mg/L，克林霉素0.024mg/L，紅霉素0.064mg/L，慶大霉素0.5mg/L 和青霉素0.024mg/L。

2.2 基因組分析 應(yīng)用軟件組裝卡明斯假谷氨酸桿菌的基因組，共得到300 個Scaffolds，基因組總長度2 456 693 bp，GC 含量58.39%，N50 長度253 401bp，N90 長度35 124 bp，最長片段為46 768 bp，最短片段212 bp。Glimmer 軟件預(yù)測顯示卡明斯假谷氨酸桿菌的基因組中存在2 097 個編碼基因，其基因總長度2 048 412 bp，占基因組全長的60.02%，基因平均長度976.83bp，見圖2。基因組中17 個散在重復(fù)序列的總長1 752bp，其中SINE 轉(zhuǎn)座子17，LINE 轉(zhuǎn)座子6。331 個串聯(lián)重復(fù)序列的總長71 570 bp，其長度分布范圍45～124 bp。tRNAscan-SE v2.0 軟件預(yù)測基因組含有70 個tRNA 基因，Barrnap 軟件預(yù)測基因組含有8 個rRNA 基因。Antismash 軟件預(yù)測到基因組中存在3 個基因，見圖3。

圖2 卡明斯假谷氨酸桿菌基因長度分布

圖3 卡明斯假谷氨酸桿菌基因島中的基因分布

2.3 基因功能注釋

2.3.1 COG 數(shù)據(jù)庫注釋：COG 蛋白數(shù)據(jù)庫可以預(yù)測與已知蛋白具有同源性的蛋白。將卡明斯假谷氨酸桿菌的基因序列與COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示1 768 個卡明斯假谷氨酸桿菌的基因編碼蛋白功能與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、維生素代謝、能量代謝等活動有關(guān)，見圖4。

圖4 卡明斯假谷氨酸桿菌蛋白質(zhì) COG 聚類分析

2.3.2 GO 數(shù)據(jù)庫注釋：GO 數(shù)據(jù)庫可對基因編碼蛋白的細(xì)胞定位、功能及其參與的生物過程進(jìn)行聚類分析。通過與GO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，成功注釋1 431 個蛋白，見圖5。其中，427 個蛋白功能未知，豐度最高的已知功能蛋白參與DNA 復(fù)制、重組以及修復(fù)。其他參與能量代謝、脂類代謝、氨基酸代謝和轉(zhuǎn)錄等生命活動的蛋白豐度也較高。

圖5 卡明斯假谷氨酸桿菌蛋白質(zhì) GO 聚類分析

2.3.3 KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋：KEGG 數(shù)據(jù)庫可預(yù)測基因編碼蛋白參與的生物通路。KEGG 分析顯示，富集卡明斯假谷氨酸桿菌的編碼蛋白的生物通路主要集中在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、維生素代謝、脂類代謝及遺傳信息的傳遞和表達(dá)等，見圖6。

圖6 卡明斯假谷氨酸桿菌KEGG 代謝通路分析

2.4 碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫注釋CAZy 數(shù)據(jù)庫包含參與碳水化合物代謝的各種酶的信息。應(yīng)用CAZy 數(shù)據(jù)庫分析顯示，卡明斯假谷氨酸桿菌具有27 個碳水化合物代謝相關(guān)酶，根據(jù)序列特征可具體分為碳水化合物酯酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物結(jié)合模塊和輔助活動蛋白（主要與氧化還原相關(guān)）。

2.5 次級代謝基因簇分析 卡明節(jié)桿菌屬于放線菌，而放線菌通常會合成豐富的次級代謝產(chǎn)物?；蛐蛄斜葘︼@示，卡明節(jié)桿菌的1 個基因簇內(nèi)包含21 個與β-內(nèi)酯（β-lacton）合成有關(guān)的基因，見圖7。

圖7 次級代謝基因簇分析

2.6 抗生素抗性相關(guān)基因 見圖8?；蛐蛄蟹治鲲@示，卡明節(jié)桿菌的基因與已知抗藥基因具有同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)卡明節(jié)桿菌有89個抗藥相關(guān)基因，分布于基因組的1～8，10～14 等區(qū)域，其作用分別與截短側(cè)耳素、莫匹羅星、四環(huán)素、林可酰胺、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、唑烷類抗生素、利膽醇類抗生素、鏈霉殺陽菌素、利福霉素、肽類抗生素、氨基香豆素、糖肽類抗生素、氨基糖苷類抗生素、頭孢菌素、頭霉素、青霉烷、硝基咪唑、雙環(huán)霉素、二氨基嘧啶、氟喹諾酮、單菌霉素、磺胺、甘氨酰環(huán)素和磷霉素等抗生素的抗性有關(guān)。

圖8 抗生素抗性相關(guān)基因

2.7 致病性基因 見圖9?？魉辜俟劝彼釛U菌的基因組中發(fā)現(xiàn)377 個基因與其他病原微生物具有同源性，其中208 個基因與可感染哺乳動物的病原微生物如空腸彎曲桿菌。金黃色葡萄球菌等有同源性。208 個基因中的99 個被確定為其編碼產(chǎn)物為毒力因子。

圖9 致病性基因

3 討論

卡明斯假谷氨酸桿菌分布廣泛，是土壤中最常被分離到的細(xì)菌之一。研究發(fā)現(xiàn)，卡明斯假谷氨酸桿菌在自然界廣泛分布的原因之一是其具有在溫度變化、饑餓、氧自由基、電離輻射和有毒化合物等惡劣環(huán)境中長期存活的能力[3]。近年來，許多研究聚焦于卡明斯假谷氨酸桿菌分解有機(jī)物的作用。

本研究首次報道了腫瘤患者血培養(yǎng)分離出卡明斯假谷氨酸桿菌。該患者確診上皮樣間皮瘤的同時發(fā)生了卡明斯假谷氨酸桿菌血流感染。出現(xiàn)這種情況的原因之一可能是由于腫瘤過度消耗營養(yǎng)導(dǎo)致患者免疫力下降。另外，根據(jù)患者出現(xiàn)胸腹腔積液和小支氣管阻塞的CT 結(jié)果推斷，腫瘤細(xì)胞有可能向患者其他組織侵襲浸潤并造成解剖屏障會被破壞[4-5]。如果腫瘤細(xì)胞浸潤到氣道，有可能導(dǎo)致患者在呼吸過程中吸入的卡明斯假谷氨酸桿菌進(jìn)入黏膜下，并在其產(chǎn)生的侵襲相關(guān)致病因子的幫助下侵入血流。當(dāng)患者機(jī)體免疫力下降時，入侵的卡明斯假谷氨酸桿菌就引發(fā)血流感染。

隨著測序技術(shù)發(fā)展和測序成本下降，全基因組測序在近年來開始被應(yīng)用于病原體鑒定[6]。與傳統(tǒng)的根據(jù)生化及免疫特征鑒定病原菌的檢測技術(shù)相比，全基因組測序可以快速獲得結(jié)果。與質(zhì)譜法相比，全基因組測序不僅可鑒定微生物種類，而且可提供其代謝特點(diǎn)、致病基因及耐藥基因等多方面信息，可為抗感染治療提供更有價值的指導(dǎo)意見[7]。本案例對患者采取了卡鉑化療。由于鉑類化療通常會導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞下降[8]，從而增加了患者發(fā)生感染的風(fēng)險。因此，選用合適的抗生素對于指導(dǎo)抗卡明斯假谷氨酸桿菌感染用藥以及預(yù)防院內(nèi)感染具有重要意義。

本研究用全基因組測序分析了卡明節(jié)桿菌菌株基因組序列。此前尚未有卡明斯假谷氨酸桿菌菌株基因組序列的相關(guān)報道。且全基因組分析為微生物的致病性及耐藥性分析提供了有價值的指導(dǎo)意見。測序結(jié)果顯示，該患者卡明節(jié)桿菌無碳青霉素烯類抗生素的抗性基因，據(jù)此選擇亞胺培南進(jìn)行治療后患者的感染迅速得到控制。本案例證明全基因組測序作為一種新的技術(shù)在指導(dǎo)臨床用藥方面具有重要價值?？梢钥焖龠M(jìn)行病原鑒定和分析的技術(shù)對于提高腫瘤患者的治療效果具有更加重要的意義。相信隨著全基因組測序技術(shù)的普及，它必將成為腫瘤治療的常規(guī)輔助檢測手段。另外，對于臨床不明原因的發(fā)熱，要重視血培養(yǎng)檢測的應(yīng)用，尤其應(yīng)注意在用藥前不同部位多次采集血液，結(jié)合血培養(yǎng)鑒定及藥敏結(jié)果，及時與臨床溝通，加強(qiáng)抗生素的合理應(yīng)用。卡明斯假谷氨酸桿菌在臨床實(shí)驗(yàn)室較少見。因此在結(jié)果判斷方面，首先要排除污染問題。這就要求臨床嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作手冊采樣，同時送兩套不同部位的血培養(yǎng)樣本。

與其他革蘭陽性菌相比，卡明斯假谷氨酸桿菌臨床病例很少見。目前國內(nèi)外有關(guān)該菌對人類疾病感染的研究較少，缺乏實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。本研究使臨床微生物專業(yè)人員全面深入了解卡明斯假谷氨酸桿菌菌株，通過全基因組測序方法，獲得卡明斯假谷氨酸桿菌的基因組序列。通過多種生物信息學(xué)分析方法，對該菌株的基因組功能進(jìn)行分析預(yù)測，將為后續(xù)挖掘更多有特殊功能的細(xì)菌編碼基因、分泌蛋白和次級代謝產(chǎn)物，以及構(gòu)建基因工程菌株打下基礎(chǔ)。