糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期篩查的臨床價(jià)值

王 緣 ，李 蓉 ，陳嬌嬌 ，申艷麗 ，胡鳳娣

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科，云南 昆明 650118）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家中的發(fā)病率超過其他癌癥[1]，嚴(yán)重威脅著人類身體健康。根據(jù)全球癌癥發(fā)病率和死亡率的統(tǒng)計(jì)，2020 年結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中位居第3和第2[2]。結(jié)直腸癌多由腺瘤發(fā)展而來，早期多無明顯癥狀，故大多數(shù)患者被診斷時(shí)已為中期或晚期，錯(cuò)過臨床治療的最佳時(shí)間。有研究表明，通過對(duì)高危人群早期篩查可以提高結(jié)直腸癌的生存率并降低其死亡率[3]。因此，結(jié)直腸癌的早期篩查臨床上具有重要意義。

結(jié)直腸癌的早期篩查的主要目的是檢測(cè)癌前病變和早期癌癥，進(jìn)行早期治療，提高患者生存率，因此，結(jié)直腸癌早期篩查的方法必須足夠敏感。目前，結(jié)直腸癌早期篩查的方法多種多樣，但仍存在一定局限性，患者依從率不高[4]。作為結(jié)直腸癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)直腸鏡檢查對(duì)結(jié)腸直腸癌有較高的敏感性和特異性，具有篩查診斷和治療的雙重功能，但結(jié)直腸鏡是一項(xiàng)高成本且具有侵入性的檢查，其操作伴隨著一系列的風(fēng)險(xiǎn)消化道出血、腸穿孔等并發(fā)癥，嚴(yán)重可能致命，不宜用于大規(guī)模的結(jié)直腸癌普查。同時(shí)，患者在結(jié)直腸鏡治療前需要進(jìn)行充分的腸道準(zhǔn)備和鎮(zhèn)靜，且已有研究證明腸道準(zhǔn)備對(duì)結(jié)直腸鏡診斷和篩查的效果起著決定性因素[5]，未完成腸道準(zhǔn)備而取消結(jié)直腸手術(shù)的比例高達(dá)26.00%[6]。結(jié)直腸鏡檢查漏診率較高，漏診主要集中在近端結(jié)腸，并且隨著年齡的增高漏診率也在不斷增高[7]?，F(xiàn)在，篩查結(jié)直腸癌常用的無創(chuàng)技術(shù)手段是包括糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult based test，F(xiàn)OBT）和糞便免疫化學(xué)檢測(cè)（faecal immunochemical test，F(xiàn)IT）。FOBT 易受飲食、藥物以及上消化道出血的影響，F(xiàn)IT 相對(duì)FOBT 來說，檢測(cè)效率提高，但FIT 對(duì)腺瘤不敏感[8]，檢出率低，特異性不高，兩種檢測(cè)均容易出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果，會(huì)使一部分人群接受不必要的結(jié)直腸鏡檢查，對(duì)結(jié)直腸癌早期篩查存在明顯的局限性。

對(duì)于結(jié)直腸癌患者來說，尋找一個(gè)無創(chuàng)、便捷且精確性高的早期篩查的手段是非常有必要的。有研究表明非侵入性生物標(biāo)志物的受檢者接受度高，因此，非侵入性生物標(biāo)志物的應(yīng)用可能會(huì)提高結(jié)直腸癌的早期篩查的參與率[9]。此外，對(duì)于結(jié)直腸癌高危人群以及希望早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤的患者來說，精確性高的非侵入性檢測(cè)非常具有吸引力。因此，本研究旨在探究糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸癌早期篩查中的臨床價(jià)值，為結(jié)直腸癌的早期篩查提供新的理論基礎(chǔ)，提高結(jié)直腸癌患者的生存率。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2021 年3 月至2022 年10 月內(nèi)昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院門診和住院收治的87 例入組人群的一般臨床資料。其中，男性71 例，女性16 例，年齡為20～85 歲；結(jié)直腸正常者41 例，年齡（42.17±13.54）歲；結(jié)直腸腺瘤患者21 例，年齡（42.38±14.19）歲；結(jié)直腸癌患者25 例，年齡（54.24±11.79）歲。疾病均已經(jīng)結(jié)直腸腸鏡和病理診斷證實(shí)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)[10]：健康組：不患有嚴(yán)重疾病，遺傳性和家族性疾病，自愿行結(jié)直腸鏡檢查；腺瘤組和結(jié)直腸癌組均經(jīng)結(jié)直腸鏡確診；腺瘤組：僅患有結(jié)直腸腺瘤，除此之外不患有其他腫瘤疾??；結(jié)直腸癌組：僅患有結(jié)直腸癌，除此之外不患有其他腫瘤疾?。荒c癌患者均未行放化療，無抗腫瘤治療史。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：存在免疫系統(tǒng)病者；正在進(jìn)行其他科學(xué)研究的患者。所有研究參與者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糞便樣本采集收集87 例受檢人群正常飲食情況下的糞便標(biāo)本，取樣4.5 g 糞便置于糞便收集管中。

1.3.2 糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)本研究將嚴(yán)格按照人類SDC2 基因甲基化檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行了糞便SDC2 基因甲基化的檢測(cè)，其主要步驟如下：（1）DNA 提??；（2）亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化；（3）使用Roche LightCycler 480 II 儀器對(duì)DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；（4）按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)，PCR 使用?actin 作為內(nèi)參照，試劑盒中提供了陰性和陽性對(duì)照，每一次檢測(cè)都需要同時(shí)檢測(cè)陰性和陽性對(duì)照。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)

在樣本質(zhì)量合格的條件下以SDC2 基因甲基化循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為準(zhǔn)，Ct 值≤38為陽性結(jié)果；Ct 值 >38 時(shí)為陰性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 29.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及占比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC curve）判斷診斷靈敏度和特異度，通過曲線下面積（area under the curve，AUC）判斷診斷效果。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SDC2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果

本研究中，健康組、腺瘤組與結(jié)直腸癌組3組之間的性別無明顯差異（P=0.113）；但組間年齡具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），結(jié)直腸癌組的發(fā)病年齡相對(duì)較晚；并且SDC2 基因甲基化的陽性表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤及癌變具有相關(guān)性，見表1。與健康組相比，SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中均顯著高表達(dá)，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)尤為顯著，Ct 值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見表2。在受檢人群中，SDC2 基因甲基化檢測(cè)在腺瘤組和結(jié)直腸癌兩組人群糞便樣本中的陽性率分別為57.14%（12/21）和84.00%（21/25），SDC2基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸癌的陽性率明顯高于檢測(cè)結(jié)直腸腺瘤的陽性率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044），見表3。故隨著疾病的進(jìn)展，SDC2 基因甲基化的水平不斷加深，檢測(cè)的陽性率也在不斷提高。

表1 87 例入組人群的一般臨床資料（）Tab.1 General clinical information of the 87 enrolled cases（）

表1 87 例入組人群的一般臨床資料（）Tab.1 General clinical information of the 87 enrolled cases（）

*P <0.05。

表2 糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況比較（）Tab.2 Comparison of fecal SDC2 gene methylation expression in colorectal adenoma and colorectal cancer（）

表2 糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況比較（）Tab.2 Comparison of fecal SDC2 gene methylation expression in colorectal adenoma and colorectal cancer（）

*P <0.05。

表3 糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌的陽性率[（n）%]Tab.3 Positive fecal SDC2 gene methylation for detection of colorectal adenoma and colorectal cancer [（n）%]

2.2 SDC2 基因甲基化早期診斷結(jié)直腸癌的靈敏度和特異度

在糞便標(biāo)本基因檢測(cè)中，SDC2 基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌的曲線下面積（AUC）分別為0.715、0.918，靈敏度分別為57.14%、88.00%，特異度分別為95.12%、92.68%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010，P<0.001），見表4。本研究也分別繪制了結(jié)直腸腺瘤（圖1）和結(jié)直腸癌（圖2）的ROC 曲線。上述數(shù)據(jù)表明糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌診斷上準(zhǔn)確性均較高，隨著疾病的進(jìn)展，SDC2 基因甲基化的水平不斷加深，檢測(cè)的準(zhǔn)確性也在不斷提高。

圖1 糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸腺瘤的ROC曲線Fig.1 ROC curve of fecal SDC2 gene methylation for detection of colorectal adenoma

圖2 糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸癌的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of fecal SDC2 gene methylation for detection of colorectal cancer

表4 糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的診斷價(jià)值Tab.4 Diagnostic value of fecal SDC2 gene methylation in colorectal adenoma and colorectal cancer

3 討論

通為最具侵襲性的惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)緩慢的過程，大多從良性或非癌形式開始。目前有研究認(rèn)為結(jié)直腸癌發(fā)病可能與生活方式、環(huán)境壓力等因素有關(guān)[11]，其早期多無明顯癥狀，隨著腫瘤的不斷發(fā)展，當(dāng)其出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，結(jié)直腸癌大多已經(jīng)進(jìn)入中晚期，錯(cuò)過了最佳臨床治療時(shí)間，預(yù)后不良。同時(shí)，隨著經(jīng)濟(jì)不斷地發(fā)展，我國(guó)飲食習(xí)慣逐漸西方化，結(jié)直腸癌的總體發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[12]。結(jié)直腸癌的早期篩查加上適當(dāng)干預(yù)能降低結(jié)直腸癌發(fā)病率，提高患者生存率，并改善患者預(yù)后。

目前常見的結(jié)直腸癌早期篩查的方法各有利弊，人群篩查的依從性均不高[13]。作為結(jié)直腸癌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)直腸鏡檢查被廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早期篩查中，但由于其侵入性強(qiáng)，價(jià)格昂貴[14]以及有一定的穿孔和出血風(fēng)險(xiǎn)，存在一定漏診率，導(dǎo)致患者依從率較低。FOBT 因其成本低和非侵入性成為應(yīng)用較為廣泛的結(jié)直腸癌篩查技術(shù)，但由于該檢測(cè)方法通常收到較多混雜因素的影響，單獨(dú)使用FOBT 在結(jié)直腸癌篩查中靈敏度和特異度均較低。FIT 在現(xiàn)階段是具有高成本效益的一種非侵入性結(jié)直腸癌篩查的方法，相較于FOBT 來說受到食物和藥物的影響較小，所需糞便樣本量較少，但FIT 對(duì)結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌的檢出率均低于結(jié)直腸鏡檢查[15]，對(duì)結(jié)直腸癌早期篩查的效果一般。因此，迫切需要更方便、精確且無創(chuàng)的診斷方法來進(jìn)行結(jié)直腸癌的早期篩查。隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，作為重要表觀遺傳修飾過程之一的DNA 甲基化在結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值得到重視。有研究表明在新型非侵入性方法中，檢測(cè)DNA 甲基化異常水平的變化更適用于臨床[16]，并且DNA 甲基化具有高穩(wěn)定性利于檢測(cè)，因此檢測(cè)生物標(biāo)志物DNA 甲基化的異常水平變化被認(rèn)為是診斷癌癥的理想方法。

DNA 甲基化是一個(gè)以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，并在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，將甲基添加到特定堿基的過程。已有研究證明DNA 甲基化水平異常變化是癌癥發(fā)生的標(biāo)志，啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化使腫瘤抑制基因啟動(dòng)子處于整體低甲基化和局部高甲基化進(jìn)而使抑癌基因失活，提高腫瘤發(fā)生率[17]。并且糞便DNA 甲基化水平改變與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，該水平變化常發(fā)生在結(jié)直腸癌早期[18]。在臨床上，堿性的腸道環(huán)境被認(rèn)為可以促進(jìn)腫瘤DNA 的保留，并能更好的確保糞便DNA 的質(zhì)量更好。因此，檢測(cè)糞便樣本中異常的DNA 甲基化水平是早期篩查結(jié)直腸癌的理想方法。

黏結(jié)蛋白聚糖2（SDC2）是一類跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞與環(huán)境之間的相互作用，編碼SDC2 蛋白，影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。近期有研究顯示SDC2 基因甲基化是結(jié)直腸癌中一個(gè)新的表觀遺傳標(biāo)志物[20]，同時(shí)證明結(jié)直腸癌的病變部位、浸潤(rùn)深度、病變轉(zhuǎn)移部位、病理分期等臨床特征與SDC2 基因甲基化無關(guān)[21]，這表明SDC2基因甲基化水平在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的改變很有可能早于其組織病理學(xué)改變。同時(shí)，有研究表明在結(jié)直腸癌的早期篩查中檢測(cè)糞便中的SDC2 基因甲基化水平具有較高的臨床價(jià)值[22]。

通過對(duì)比糞便SDC2 基因在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的甲基化水平，本研究發(fā)現(xiàn)在患者出現(xiàn)癌前病變（結(jié)直腸腺瘤）時(shí)，DNA 甲基化水平已經(jīng)發(fā)生改變，并且隨著癌變進(jìn)程SDC2 甲基化水平不斷加深。同時(shí)，本研究證明SDC2 基因甲基化在診斷結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中均具有較高的特異度，并且隨著疾病逐漸演變，SDC2 基因甲基化診斷的靈敏度也在不斷升高，對(duì)結(jié)直腸癌的早期篩查具有很高的臨床價(jià)值。

Syed A R 等[23]通過使用全國(guó)性數(shù)據(jù)庫Explorys進(jìn)行基于人群的隊(duì)列分析，篩選出2012 年1 月至2016 年12 月所有具有活躍電子病歷且診斷為結(jié)直腸癌的患者，其中共有68 860 名患者被確診為結(jié)直腸癌，其中5 710 例（8.3%）年齡在25～50歲之間，63 010 例（91.50%）年齡大于50 歲，排除年齡小于25 歲的140 例，證明年齡與結(jié)直腸癌發(fā)病率有一定關(guān)系；并且該研究通過對(duì)比早發(fā)型結(jié)直腸癌隊(duì)列（25～49 歲）和對(duì)照組（25～49 歲內(nèi)未診斷為結(jié)直腸癌者）發(fā)現(xiàn)男性和結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。本研究通過對(duì)樣本的一般資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)健康組、腺瘤組與結(jié)直腸癌3 組之間的性別無明顯差異，但組間年齡有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)直腸癌組中當(dāng)患者年齡超過44 歲時(shí)，結(jié)直腸癌發(fā)病率更高。

綜上所述，糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)是一種基于糞便樣本的無創(chuàng)、便利、快捷的新型技術(shù)，在結(jié)直腸癌早期篩查中有著較高的特異度，并且隨著癌變進(jìn)程靈敏度不斷升高，因此能更好地發(fā)現(xiàn)和追蹤癌前病變，具有很高的臨床價(jià)值。因此，糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸癌的早期篩查中是一個(gè)非常重要的指標(biāo)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，本研究設(shè)計(jì)還是具有一定局限性，如樣本量小，樣本來源單一等。因此，未來仍需要增加樣本量進(jìn)行大量的研究，進(jìn)一步證實(shí)糞便SDC2 基因甲基化在結(jié)直腸癌早期篩查中的臨床價(jià)值。