Th17 和Treg 細(xì)胞與慢性光化性皮炎的相關(guān)性

楊成林 ，胡 婕 ，王 靜 ，王敏華 ，黃 玲

（1）大理護(hù)理職業(yè)學(xué)院內(nèi)科教研組，云南 大理 671000;2）六安市中醫(yī)院皮膚科，安徽 六安 237000;3）復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院皮膚科，上海 200540;4）大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，云南 大理 671001）

慢性光化性皮炎（chronic actinic dermatitis，CAD）是一種慢性的、能持續(xù)影響曝光部位皮膚的光誘導(dǎo)性皮炎，50～70 歲的老年男性為好發(fā)人群，皮損反復(fù)發(fā)作可以持續(xù)數(shù)年乃至更久，這就給CAD 的患者帶來了極大的痛苦，其病因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，既往研究認(rèn)為，T 細(xì)胞亞群與CAD 的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[1]。CAD 患者中也可能存在輔助性T 淋巴細(xì)胞17（Th17 cells）和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Treg cells）細(xì)胞的失衡，筆者對CAD 患者的Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)作相關(guān)性分析，以期為揭示CAD 的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科2017 年1月至2018 年12 月收治并確診的CAD 患者25 例，符合Norris 和Hawk 診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。同時隨機(jī)選取20 名至大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢的健康志愿者作為對照組，對照組與CAD 患者的性別年齡等一般資料，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性（P>0.05）。CAD 患者排除標(biāo)準(zhǔn)[3]：（1）有其他光敏性皮膚病的患者；（2）對測試的變應(yīng)原過敏者；（3）有機(jī)體抵抗力低下，嚴(yán)重器質(zhì)性疾病的患者（肝功能衰竭、急慢性腎功能損傷、心肺功能不全、活動性肺結(jié)核、甲亢等）；（4）孕婦和哺乳期婦女；（5）測試區(qū)有局部感染者；（6）試驗(yàn)之前停用糖皮質(zhì)激素類藥物未達(dá)1 周及停用免疫抑制劑未達(dá)2 周，停用抗組胺藥未達(dá)（2～3）d 者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）測試者擁有CAD 診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任意一項；（2）近3 月來有疾病發(fā)生；（3）近期使用過糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選病例均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

流式細(xì)胞術(shù)檢測25 例CAD 患者及20 名健康志愿者外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞中Th17 細(xì)胞/Tregd 的比值，同時應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測25例CAD 患者和10 例健康對照組（因前述健康對照組中有10 例志愿者不同意進(jìn)行皮膚活檢，故選取另外10 例）皮膚組織皮損白介素-17（IL-17）；叉頭轉(zhuǎn)錄因子p3（Foxp3）的表達(dá)。

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞百分比人類Treg/Th17 試劑盒及同型對照抗體購自BD 公司?？崭共杉? mL EDTA 抗凝外周血將50 μL EDTA 抗凝外周血加入離心管封口，40 ℃低溫孵育15 min；按Treg/Th17 試劑盒說明依次加入抗體充分混勻后，孵育30 min，進(jìn)行表面標(biāo)記；加入紅細(xì)胞裂解液 2 mL，4 ℃避光孵育10 min，1200 r/min 離心5 min，棄上清；加入流式染色緩沖液，1200 r/min 離心5 min，離心棄上清；重復(fù)上述操作1 次，使離心管底部顏色接近透明或呈淡黃色；加入0.5 mL 流式染色緩沖液重懸固定，4 ℃保存，2 h 內(nèi)上機(jī)檢測。使用美國BD 公司流式細(xì)胞儀[FACS Canto ⅡPlus（3 激光10 色）]進(jìn)行檢測，上樣檢測后用Flowjo 軟件進(jìn)行分析，自動獲得Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞在外周血CD4+T 中的百分率。Treg 細(xì)胞結(jié)果判讀是否為CD4+T 細(xì)胞中被標(biāo)記為CD4+CD25+CD127 陰性或弱表達(dá)；Th17 檢測結(jié)果判讀為CD4+CD196+CD183-。

1.2.2 免疫組化法檢測IL-17 和Foxp3 的表達(dá)兔抗人foxp3 多克隆抗體及羊抗人IL-17 多克隆抗體均購于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。將標(biāo)本切片（4 μm 厚度）脫蠟、水化、烤片、沖洗后，3%H202去離子水孵育15 min，PBS 沖洗3×5 min，將切片置于EGTA 抗原修復(fù)液中修復(fù)。PBS 沖洗3×3 min，除去PBS 液，每張切片加非特異性染色阻斷劑1～2 滴，室溫下孵育15 min。傾去，每張切片上滴加1～2 滴的一抗試劑。其中鼠抗人IL-17 多克隆抗體（工作濃度為 1∶200）、兔抗人Foxp3 多克隆抗體（工作濃度為 1∶200）。切片在4 ℃冰箱過夜后在室溫下靜置30～60 min，PBS沖洗3×5 min。除去PBS 液，每張切片加酶標(biāo)羊抗鼠或兔IgG 聚合物60 μL，室溫下孵育15 min。PBS 沖洗3×5 min。濾紙除去PBS 液，將DAB 顯色液滴加到切片上，每張切片滴加約60 μL，室溫下顯色2～3 min，鏡下觀察切片細(xì)胞的變化，當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)明顯棕色或棕黃色顆粒時及時將顯色液甩掉，

清水沖洗切片，使顯色反應(yīng)終止。用肺鱗癌組織、小腸上皮組織作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照，HE 染色作組織學(xué)對照。以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核有棕黃色或深褐色顆粒為陽性。Foxp3 陽性定位于淋巴細(xì)胞中細(xì)胞核，胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，IL-17 陽性定位于淋巴細(xì)胞中細(xì)胞漿，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性。光鏡下每張切片中選取淋巴細(xì)胞較多的5 個高倍視野。根據(jù)5 個視野中出現(xiàn)陽性細(xì)胞的個數(shù)來計算百分比：胞核或胞漿在顯微鏡下顯色呈棕黃色或棕褐色的細(xì)胞個數(shù)≥6%為陽性；<5%為陰性（-）。根據(jù)細(xì)胞著色深淺記分：未著色計0 分；淡黃色計1 分；棕黃色計2 分；棕褐色計3 分。以上2 種記分總得分除以2 為最終得分。0～0.5分為陰性（-）；1～3 分為陽性（+）。

1.2.3 CAD 患者皮損嚴(yán)重程度評分按Hanifin J M 等據(jù)PASI 評分修訂的EASI 評分表[4]對25 例CAD 患者皮損嚴(yán)重程度進(jìn)行評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較使用t檢驗(yàn)，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAD 患者皮損嚴(yán)重程度評分

25 例慢性光化性皮炎患者EASI 評分為 6.8～33.95 分，平均（17.42±7.66）分。

2.2 Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

Th17 細(xì)胞原始散點(diǎn)圖分區(qū)明顯，CAD 患者Th17 細(xì)胞分布顯著高于對照組（圖1～2）；Treg細(xì)胞原始細(xì)胞散點(diǎn)圖細(xì)胞分區(qū)明顯，CAD 患者Treg 細(xì)胞顯著低于對照組（圖1～2）。與健康志愿者相比，CAD 患者Th17 細(xì)胞在外周血CD4+T 細(xì)胞中所占比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.15，P<0.05）；CAD 患者Treg 細(xì)胞在外周血CD4+T 細(xì)胞中所占比例明顯少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.414，P<0.01）；CAD 患者的Th 17/Treg 顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.930，P<0.01），見表1。

表1 各組Th17 細(xì)胞，Treg 細(xì)胞比例及Th17/Treg 比值（）Tab.1 Th17 cells，Treg cell ratio and Th17/Treg ratio in each group

表1 各組Th17 細(xì)胞，Treg 細(xì)胞比例及Th17/Treg 比值（）Tab.1 Th17 cells，Treg cell ratio and Th17/Treg ratio in each group

與健康對照組比較，*P <0.05，**P <0.01。

圖1 CAD 患者Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.1 Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in CAD

圖2 健康對照組Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.2 Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in healthy control group

2.3 CAD患者Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg 比值與EASI 評分相關(guān)性分析結(jié)果

Th17 細(xì)胞和Th17/Treg 的比值隨EASI 評分的增加而增加、Treg 細(xì)胞隨EASI 評分的增加而減少，可初步判斷Th17 細(xì)胞和EASI 評分之間、Treg 細(xì)胞和EASI 評分之間以及Th17/Treg 比值和EASI 評分之間有近似線性關(guān)系，進(jìn)一步做Person直線相關(guān)分析：Th17 細(xì)胞和EASI 評分的相關(guān)系數(shù)r=0.985，P=0.000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示2 者間存在正相關(guān)關(guān)系；Treg細(xì)胞和EASI 評分的相關(guān)系數(shù)r=-0.846，P=0.000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示2 者間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；Th17/Treg 比值和EASI 評分的相關(guān)系數(shù)r=0.97，P=0.000，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示2 者間存在正相關(guān)關(guān)系，見圖3。

圖3 Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞和Th17/Treg 的比值與EASI 評分相關(guān)性分析Fig.3 Analysis of EASI score between the ratio of Th17 cells，Treg cells，and Th17/Treg

2.4 CAD 病例組與健康對照組免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果比較

Foxp3 陽性染色定位于細(xì)胞核，IL-17 陽性染色定位于胞漿，CAD 病例組Foxp3、IL-17 陽性細(xì)胞主要分布在真皮淺層淋巴細(xì)胞。健康對照組二者僅在部分標(biāo)本的真皮淺層呈弱陽性表達(dá)。CAD 病例組與健康對照組間Foxp3 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.373，P>0.05）。CAD 病例組與健康對照組間IL-17 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.288，P<0.05）；見表2、表3、圖4（a，b，c，d），圖5（e，f，g，h）。

表2 Foxp3 在CAD 病例組與健康對照組皮膚中表達(dá)差異（n）Tab.2 The difference of Foxp3 expression in skin（n）

表3 IL-17 在CAD 病例組與健康對照組皮膚中表達(dá)差異（n）Tab.3 The difference of IL-17 expression in skin（n）

圖4 健康對照組皮膚組織的免疫組織化學(xué)Fig.4 Immunohistochemistry of skin tissue in healthy control group

圖5 CAD 皮膚組織的免疫組織化學(xué)Fig.5 Immunohistochemistry of skin tissue in CAD

3 討論

目前普遍認(rèn)為CAD 的發(fā)病機(jī)制為光敏物質(zhì)與皮膚結(jié)合形成的新抗原誘導(dǎo)的DTH。DTH 主要由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，而T 淋巴細(xì)胞可分為CD4+和CD8+2 大亞群，Treg 及Th17 細(xì)胞均是CD4+T 細(xì)胞的一個亞群。陳浩、鄧丹琪等[5]用免疫組化的方式發(fā)現(xiàn)，CAD 患者皮損內(nèi)存在有Th 細(xì)胞和Tc細(xì)胞，在早期主要以CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的DTH 為主，晚期則以CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的DTH 為主。由此推測，在CAD 起病的早期過程中，CD4+T 細(xì)胞扮演著重要的角色，尤其是CD4+T 細(xì)胞的2 個重要亞群Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞在慢性光化性皮炎的發(fā)生與發(fā)展中可能起著重要的作用。

Th17 細(xì)胞分泌IL-6、IL-17、IL-22、腫瘤壞死因子（TNF-α）等細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)免疫功能。IL-17 在很多種自身免疫性疾病患者的血清和組織中均呈現(xiàn)了極高表達(dá)。免疫反應(yīng)中IL-17 有促進(jìn)炎癥發(fā)生的重要作用。其功能主要表現(xiàn)在2 個方面：在全身性反應(yīng)中對中性粒細(xì)胞的募集、成熟和激活作用，研究發(fā)現(xiàn)缺乏IL-17 或者Th17 會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞缺陷以及對金黃色葡萄球菌和真菌等抵抗力減弱[6?7]；另一方面它還能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子，例如IL-6、IL-8 和CCL20，從而加重炎癥[8]。IL-17 通過受體與異二聚體復(fù)合物相結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。IL-17 在宿主對抗外界病原體的固有免疫防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)中筆者先通過標(biāo)記CD4+CD196+CD183-等表面抗原來界定Th17 細(xì)胞，結(jié)果顯示CAD 患者Th17 細(xì)胞在外周血CD4+T 細(xì)胞中所占比例高于健康對照組。免疫組化法同樣發(fā)現(xiàn)IL-17 在CAD 皮損中的分布明顯高于健康對照組。提示IL-17 作為一個重要的促炎因子，在CAD 的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在CAD 的慢性期，CAD 患者與健康體檢者組的IL-17 相比，無統(tǒng)計學(xué)差異，推測IL-17 主要在疾病的急性期發(fā)揮作用[11]。這也提示可嘗試通過影響Th17 的增殖分化達(dá)到治療目的，其分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22，TNF-α 可以作為CAD 新的治療靶點(diǎn)，嘗試CAD 靶向治療方案。

Treg 細(xì)胞具有無反應(yīng)性及免疫抑制性，可通過細(xì)胞接觸觸及分泌的主要細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和IL-10 發(fā)揮其對多種免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、NK 細(xì)胞及單核細(xì)胞的抑制作用，同時維持自身免疫耐受及調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Treg 數(shù)量減少和功能下降可以導(dǎo)致Treg 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能受到損傷，這與自身免疫性疾病的發(fā)病相關(guān)[12]。本研究先使用CD4+CD25+CD127-或弱表達(dá)來界定Treg 細(xì)胞，結(jié)果顯示CAD 患者Treg 細(xì)胞在外周血CD4+T 細(xì)胞中所占比例顯著低于對照組。

Foxp3 屬于FOX 蛋白家族。許多研究已經(jīng)證明了Foxp3+Treg 細(xì)胞在控制多種免疫反應(yīng)的生理和病理中發(fā)揮重要作用，包括炎癥、自身免疫疾病和癌癥[13?14]。Foxp3+Treg 可以表達(dá)高水平的Foxp3，F(xiàn)oxp3 長期以來被認(rèn)為是控制Treg 細(xì)胞發(fā)育和功能的主要調(diào)節(jié)因子。并且Foxp3 的連續(xù)表達(dá)是維持Treg 細(xì)胞表型所必需的。本組資料中CAD 病例組與健康對照組間Foxp3、IL-17 在皮損內(nèi)的表達(dá)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 在CAD 皮損中的表達(dá)與健康對照組相似。IL-17 在CAD 皮損中的分布明顯高于健康對照組。這一結(jié)果與其他慢性炎性疾病中Foxp3 和IL-17 的表達(dá)情況相同。也與我們用流式細(xì)胞術(shù)所檢測得到的結(jié)果是相符的。

與健康志愿者相比，CAD 患者的Th17/Treg顯著高于對照組，Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞失衡可能是慢性光化性皮炎的重要的發(fā)病機(jī)制。這些年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)了慢性炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展與Th17/Treg 相關(guān)，Th17/Treg 比值升高，平衡向促炎的Th17 細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，促使炎癥發(fā)生[15?16]。在CD4+T 細(xì)胞分化成熟過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）不但可以促使原始CD4+T 淋巴細(xì)胞向Treg 細(xì)胞分化，TGF-β 還可以與IL-6一起作用于CD4+T 細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化成為Th17 細(xì)胞；Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞比例主要受到TGF-β、IL-6，IL-10，IL-23 等細(xì)胞因子的影響，因此，它們在外周血中的分化是彼此制約的。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以在IL-6、IL-1 以及TGF-β 的共同作用下重新向Th17 細(xì)胞轉(zhuǎn)化。即Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞在特定的微環(huán)境中它們能夠互相轉(zhuǎn)化，并且Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞之間存在一種動態(tài)平衡，機(jī)體可以通過改變這種平衡來改變適應(yīng)性免疫應(yīng)答的狀態(tài)；而免疫性疾病、感染以及腫瘤等疾病常常發(fā)生在該平衡被打破的時候。在本研究中，CAD 患者Th17/Treg 顯著高于對照組，存在Th17細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的失衡，Th17 細(xì)胞升高水平和EASI 評分2 者間存在正相關(guān)關(guān)系；Treg 細(xì)胞和EASI 評分2 者間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；Th17/Treg 比值和EASI 評分2 者間存在正相關(guān)關(guān)系，提示Th17/Treg 比值與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，Th17 細(xì)胞水平越高，Treg 細(xì)胞水平越低，皮損越嚴(yán)重，本研究顯示皮損中IL-17 表達(dá)增高，也提示Th17 細(xì)胞通過其分泌的細(xì)胞因子參與了CAD 的炎癥過程，發(fā)揮了促炎作用。Th17 細(xì)胞升高，促使平衡向炎癥方向轉(zhuǎn)化，可能是CAD 發(fā)病的重要機(jī)制。

綜上所述，CAD 患者存在Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞的失衡，Treg 細(xì)胞及Th17 細(xì)胞在CAD 的發(fā)病過程中起著重要作用，急性期CAD 患者Th17細(xì)胞水平升高，Th17/Treg 比值升高，可用來作為判斷CAD 病情的輔助指標(biāo)，在將來也許可為CAD 的治療提供新的靶向選擇。