恒古骨傷愈合劑聯(lián)合廣譜抗生素改善db/db 小鼠胰島素抵抗和腸道菌群

鄧紹友 ，趙玉蘭 ，王佩錦 ，李 蓉 ，李進濤 ，鄭 紅

（1）云南省執(zhí)業(yè)藥師注冊中心，云南 昆明 650101;2）昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，云南 昆明 650500）

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟的分析，預(yù)計到2045 年，糖尿病患者的數(shù)量將從2030 年的5.78 億增加到7.00 億人，這意味著世界各地的公共衛(wèi)生威脅日益增加[1]。其中2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）約占全球所有糖尿病患者的90%，是一種受遺傳和環(huán)境風(fēng)險綜合影響的復(fù)雜疾病，越來越多的研究表明微生物失調(diào)在T2DM 發(fā)病機制中的作用[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)：恒古骨傷愈合劑具有降血糖功效，可改善2 型糖尿病db/db 小鼠腸道微生態(tài)平衡[3]。廣譜抗生素引起宿主腸道菌群失調(diào)。因此，本實驗進一步探索恒古骨傷愈合劑聯(lián)合廣譜抗生素對糖尿病小鼠的作用，為進一步的藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級10 周齡雄性 db/db 小鼠和野生型小鼠，購于北京斯貝福公司[SCXK（京）2019-0010]，在昆明醫(yī)科大學(xué)[許可證SYXK（滇）2020-0006]飼養(yǎng)：室溫（23±2）℃，濕度（52±10）%，明暗交替時間為12 h。小鼠自由采食和飲水。相關(guān)操作遵守動物福利要求，試驗方案通過倫理委員會批準(zhǔn)（KMMU20220903）。

1.2 藥物和儀器

恒古骨傷愈合劑（批號：20211211）來自克雷斯制藥公司?？股兀ㄈf古霉素，氨芐西林，甲硝唑，新霉素）來自美國Sigma 公司。小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自齊一生物科技（上海）公司。血糖檢測儀為三諾生物公司制造。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與樣本采集適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w 后，野生型小鼠為對照組（wt），24 只db/db 小鼠隨機分為模型組（db 組）、恒古骨傷愈合劑組（OK 組）、廣譜抗生素組（ABX 組）、恒古骨傷愈合劑與抗生素聯(lián)合干預(yù)組（AO 組）（n=6）。OK 組以臨床成人常用劑量（按60 kg 計算），并按人和動物體表面積換算法折算等效劑量為15.3 g/(kg.2 d)，ABX 組灌胃等體積廣譜抗生素（甲硝唑1 g/L、氨芐西林1 g/L、0.5 g/L 萬古霉素和1 g/L 新霉素）、對照組、模型組灌胃等體積0.9 %氯化鈉溶液，每2 d 給藥1 次。AO 組給與恒古骨傷愈合劑與抗生素交替灌胃，共11 周。禁食 12 h，測量小鼠體重、空腹血糖，3% 戊巴比妥鈉麻醉，采心臟血離心，收集血清檢測胰島素，計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。公示為HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）× 空腹胰島素（μU/mL ）/ 22.5（校正因子）。取盲結(jié)腸內(nèi)容物0.5 g～1.0 g，分裝至無菌 EP 管，過液氮，-80 ℃保存。

1.3.2 腸道菌群16S rDNA 測序由上海百趣公司利用Illumina NovaSeq 測序平臺測序進行。具體使用Hipure Stool DNA Kits 提取DNA，對16S rDNA V3+V4 區(qū)擴增，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化PCR產(chǎn)物，ABI StepOnePlus System 定量。原始數(shù)據(jù)提交SRA 數(shù)據(jù)庫，獲得ASVs[4]，物種注釋。并進行菌群多樣性分析、差異分析及功能預(yù)測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析（方差齊）或秩和檢驗（方差不齊），多重比較用LSD 法或Nemenyi 法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣譜抗生素、恒古骨傷愈合劑單獨和聯(lián)合使用改善db/db 小鼠胰島素抵抗

與野生型比較，db/db 小鼠體重（圖1A）、空腹血糖（圖1B）和胰島素抵抗指數(shù)（圖1C）升高，血清胰島素（圖1D）含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示db/db 小鼠出現(xiàn)T2DM 的病理癥狀。與模型組（db/db ）比較，廣譜抗生素組、恒古骨傷愈合劑組和聯(lián)合用藥組空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)降低，血清胰島素含量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但各處理組體重與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖1A）。

圖1 各組小鼠體重和胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)比較（n=6）Fig.1 Comparison of the body weight and insulin resistance related indexes（n=6）

2.2 腸道菌群測序ASVs 和韋恩圖

5 組小鼠韋恩圖呈現(xiàn)小鼠間共有、特有的ASVs，其中對照組1283 個ASVs；ABX、db/db、OK、AO組的ASVs 依次增加（824 個、878 個、946 個、1 330 個），ABX 組腸道菌群ASVs 最少而AO 組最多。提示抗生素抑制腸道菌群，恒古骨傷愈合劑改善這種抑制作用。

2.3 腸道菌群豐富度和均勻性

與對照組wt 小鼠比較，db/db 組腸道菌群豐富度和均勻性相關(guān)指標(biāo)chao1、shannon、simpson和pielou-e 指數(shù)降低（P<0.05）。與db/db 組比較，OK 組菌群豐富度和均勻性增加（P<0.05）；ABX組菌群豐富度和均勻性最低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；AO 組菌群豐富度和均勻性介于db/db 與ABX 組之間，其中chao1 和simpson 指數(shù)與db/db 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。提示恒古骨傷愈合劑改善抗生素作用下的db/db 菌群的豐富度和均勻性。各組樣本覆蓋度大于99.7%，提示樣本中的物種均被檢測到（表1）。

表1 各組小鼠腸道菌群豐富度和均勻性指數(shù)（）Tab.1 Alpha-diversity index of gut microbiota in the 5 groups（）

表1 各組小鼠腸道菌群豐富度和均勻性指數(shù)（）Tab.1 Alpha-diversity index of gut microbiota in the 5 groups（）

與對照組比較，*P <0.05；與模型組比較，#P <0.05，##P <0.01。

2.4 門與科水平的腸道菌群豐度

門水平上（圖2A），db/db 和OK 組厚壁菌門（Firmicutes）（0.471，0.644）和擬桿菌門（Bacteroidota）相對豐度最高（0.366，0.259）。ABX 組變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度高達0.934，AO 組變形菌門相對豐度為0.667，其次為擬桿菌門（0.209）。進一步分析發(fā)現(xiàn)各組小鼠腸道菌門構(gòu)成有明顯差異，相對與db/db 組，OK 組厚壁菌門（P<0.05）、ABX（P<0.01）和AO 組（P<0.01）變形菌門的豐度升高，OK 組（P<0.05）、AO 組（P<0.01）和ABX（P<0.01）的擬桿菌門相對豐度降低。

圖2 菌群門、科水平豐度組成（n=6）Fig.2 The gut microbiota at the phylum and family level in 5 groups（n=6）

科層面（圖2B），db/db 小鼠和OK 組毛螺菌科（Lachnospiraceae）（0.333、0.472）和Muribaculaceae 科（0.219、0.159）群豐度最高。ABX 組腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和薩特菌科（Sutterellaceae）（0.650，0.178）豐度最高，AO 組腸桿菌科、坦納菌科（Tannerellaceae）和薩特菌科（0.390、0.162、0.130）豐度最高。5 組小鼠腸道菌科構(gòu)成差異明顯，與db/db 組比較，OK 組毛螺菌科（P<0.05）、ABX 和AO 組腸桿菌科、薩特菌科及AO 組坦納菌科的豐度均升高（P<0.01），而OK 組Muribaculaceae 豐度降低（P<0.05）。

2.5 差異菌屬篩

LEFse 分析組間菌群差異（圖3），野生型小鼠腸道菌群的優(yōu)勢物種為擬桿菌門Muribaculaceae屬和厚壁菌門瓦丁梭菌BB60 群（VadinBB60-group）、杜氏乳桿菌（Dubosiella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）。db/db 小鼠的優(yōu)勢菌屬為彎曲桿菌門螺桿菌屬（Helicobacter）和擬桿菌門另枝菌屬（Alistipes）和擬桿菌屬（Bacteroides）。OK組的優(yōu)勢菌種為厚壁菌門毛螺菌科NK4A136 組（Lachnospiraceae NK4A136 group）和乳桿菌屬（Lactobacillus），脫硫桿菌門（Desulfobacterota）脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae））和擬桿菌門的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）等。ABX 組的優(yōu)勢菌均為變形菌門，包括γ-變形菌綱腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、氣單胞菌科（Aeromonadaceae）和β-變形菌綱的薩特氏菌科（Sutterellaceae）等。AO 組腸道菌群的優(yōu)勢物種包括古氏副擬桿菌（Parabacteroides gordonii），疣微菌門阿克曼菌屬（Akkermansia）和變形菌門γ-變形菌綱腸桿菌目的摩根菌科（Morganellaceae）及α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）等。

圖3 5 組小鼠腸道菌群LEFse 分析（n=6）Fig.3 LEFse analysis of gut microbiota in 5 groups（n=6）

3 討論

糖尿病在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴病”范疇，由于先天不足、勞倦內(nèi)傷、飲食失節(jié)、情志失調(diào)等導(dǎo)致。中醫(yī)藥治療糖尿病已千余年，在“天人合一”的整體觀念指導(dǎo)下，注重對患者全身功能的調(diào)節(jié)[5]。彝藥恒古骨傷愈合劑由陳皮、紅花、三七、杜仲、人參、黃芪、洋金花、鉆地風(fēng)、鱉甲等配方制成，功能主治為活血益氣、補肝腎，符合中藥治療糖尿病的原則。課題前期發(fā)現(xiàn)恒古骨傷愈合劑改善db/db 小鼠糖尿病性骨代謝異常和降低空腹血糖[3]。由于胰島素在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用，胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）是判斷胰島素抵抗的有效指標(biāo)[6]，本實驗進一步發(fā)現(xiàn)恒古骨傷愈合劑改善db/db 小鼠胰島素抵抗。

腸道菌通過微生物-宿主共代謝系統(tǒng)影響藥物代謝。通過抗生素處理殺滅微生物是研究腸道菌群變化的替代方法?？股乜赏ㄟ^種類、劑量、給藥途徑及時間的不同，影響腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)[7]?？股卣T導(dǎo)的腸道群的改變與代謝性疾病相關(guān)，如肥胖、糖尿病等[4]。選擇廣譜抑菌且腸道內(nèi)吸收率相對緩慢的抗生素，其中包括萬古霉素、氨芐西林、甲硝唑、新霉素的組合，已被證明對腸道菌群有殺傷作用[8]。本實驗選擇了以上混合抗生素，通過比對抗生素、恒古骨傷愈合劑單獨和聯(lián)合作用于db/db 小鼠的效應(yīng)。結(jié)果顯示：經(jīng)11 周干預(yù)，抗生素、恒古骨傷愈合劑單獨和聯(lián)合作用，均降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖和胰島素抵抗，聯(lián)合用藥組效果更優(yōu)。與本實驗結(jié)果類似，出生至成年的長期抗生素暴露，通過調(diào)節(jié)腸道菌群在一定程度上抵抗高脂飲食負荷小鼠的糖代謝失調(diào)[9]。萬古霉素降低NOD 小鼠的糖尿病發(fā)病率[10]。廣譜抗生素（給藥12 d）降低db/db 小鼠隨機血糖，改變腸道微生物群組成[11]。本實驗也表明廣譜抗生素降低 db/db 小鼠腸道菌群的豐富度與均勻性。廣譜抗生素主要通過抑制擬桿菌門等常見的共生專性厭氧菌，并擴大正常情況下豐度較低變形桿菌門等兼性厭氧菌重塑腸道微生態(tài)[12?13]。相似地，本實驗也發(fā)現(xiàn)ABX 和AO 組擬桿菌門相對豐度降低，變形菌門的豐度升高。而恒古骨傷愈合劑改善抗生素作用下的菌群的多樣性。

LEFse 分析顯示野生型小鼠擬桿菌門Muribaculaceae屬和厚壁菌門瓦丁梭菌BB60 群（VadinBB60 -group）、杜氏乳桿菌（Dubosiella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等益生菌富集。Muribaculaceae屬在腸道的能量代謝、血糖血脂等發(fā)揮作用。Dubosiella的代謝產(chǎn)物為丁酸，可預(yù)防、改善肥胖。VadinBB60-group的代謝產(chǎn)物為短鏈脂肪酸，與丙酸鹽比例呈正相關(guān)[14]。較高比例的丙酸鹽會導(dǎo)致糖異生增加，減低肥胖[15]。提示野生型小鼠的標(biāo)志菌在調(diào)節(jié)血糖中發(fā)揮作用。在中國人群中，擬桿菌屬（Bacteroides）和另枝菌屬（Alistipes）在2 型糖尿病患者中比在糖代謝正常的人中更為豐富。另外，它們也與膽固醇水平升高相關(guān)[16]。糖尿病患者的幽門螺桿菌感染率明顯更高[17]。以上臨床結(jié)果與本實驗中db/db 小鼠螺桿菌屬、Alistipes和Bacteroides富集相符。大豆不溶性膳食纖維通過增加乳桿菌屬（Lactobacillus）和毛螺菌科NK4A136 組（Lachnospiraceae _NK4A136_group）與肥胖相關(guān)的潛在有益菌的相對豐度，預(yù)防高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠肥胖[18]。黃芩和黃連處理增加產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細菌Prevotellaceae UCG-001等的富集，改善2 型糖尿病大鼠糖脂代謝[19]。提示本實驗恒古骨傷愈合劑通過Lachnospiraceae NK4A136 group、Lactobacillus和Prevotellaceae 等的富集，調(diào)節(jié)糖脂代謝。而廣譜抗生素組中變形菌門γ-和β-變形菌綱的相關(guān)致病菌富集，提示抗生素雖然降低血糖，但可能導(dǎo)致重要的腸道微生物共生體從各群體中消失，使能夠提供重要健康益處的細菌物種減少[20]。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)恒古骨傷愈合劑聯(lián)合廣譜抗生素干預(yù)組中，表現(xiàn)為有益菌Parabacteroides、Akkermansia和有害菌Morganellaceae、Alphaproteobacteria 并存富集的狀態(tài)。提示盡管ABS、OK 和聯(lián)合干預(yù)下db/db 小鼠血糖及胰島素抵抗均有所改善，但從腸道優(yōu)勢菌群富集的角度，各干預(yù)組涉及的具體調(diào)控機制可能有所不同。已有研究表明狄氏副擬桿菌胞外多糖粗提物具良好的免疫調(diào)節(jié)功能，由可減輕肥胖、緩解結(jié)腸炎[21]。阿克曼菌與肥胖、糖尿病、肝臟和心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在調(diào)節(jié)機體代謝紊亂方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[22?23]。恒古骨傷愈合劑改善抗生素導(dǎo)致腸道微生態(tài)紊亂，增加改善糖代謝的有益微生物的富集。推測恒古骨傷愈合劑改善血糖、胰島素抵抗與這些有益微生物的富集有關(guān)，值得進一步探討。

綜上，廣譜抗生素、恒古骨傷愈合劑單獨和聯(lián)合作用，均降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖和胰島素抵抗。且恒古骨傷愈合劑可改善抗生素對db/db 腸道微生態(tài)損害。