獨(dú)蒜蘭的化學(xué)成分及其生物活性

周曉蓉 ，楊梅君 ，楊玥娜 ，徐明新 ，陳亞萍 ，王慧敏 ，李美紅 ，李玉鵬

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500;2）臨滄市人民醫(yī)院藥劑科，云南 臨滄 677000;3）昆明醫(yī)科大學(xué)校婦聯(lián)，云南 昆明 650500）

獨(dú)蒜蘭是獨(dú)蒜蘭屬（Pleione）植物，該屬為蘭科（Orchidaceae），獨(dú)蒜蘭不僅在長(zhǎng)江流域以南的各省區(qū)有廣泛的分布，且西南地區(qū)也有產(chǎn)出[1]。獨(dú)蒜蘭中藥材山慈菇的主要來源之一，其涼、辛、甘，具有治療風(fēng)濕疼痛、支氣管炎、肺熱咳血等癥的作用，亦可用于外傷出血、無名腫毒外傷等外傷治療[2]。據(jù)《中國藥典》記載，其歸肝、脾經(jīng)，具有化散結(jié)痰、清熱解毒的作用[3]。

1 材料與方法

1.1 研究材料

Bruker ASENDAVIIIHD 600 MHz 核磁共振儀（TMS 為內(nèi)標(biāo)）；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；三用紫外分析儀為WFH-203（2F-1）；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20：20-80 μm（Pharmacia Fine Chemical Co Ltd）；柱層析硅膠（80～100 目，200～300 目，青島海洋化工廠）；高效薄層層析硅膠G 板（煙臺(tái)化工研究院）；所用有機(jī)溶劑為工業(yè)純，經(jīng)重蒸后使用；三氯甲烷、丙酮為分析純級(jí)別；氘代甲醇、氘代丙酮、氘代氯仿、DMS。顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。3 種腫瘤細(xì)胞株A549、MCF-7/S、SKOV-3 由昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。

1.2 植物來源

本實(shí)驗(yàn)所用植物樣品于2017 年5 月采于云南大理，經(jīng)昆明植分公司婁安瑞鑒定為獨(dú)蒜蘭。標(biāo)本（編號(hào)：20170513）保存在昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

1.3 研究方法

1.3.1 提取與分離方法干燥的獨(dú)蒜蘭全草（8 kg），經(jīng)95%乙醇浸提3 次，72 h 每次，減壓濃縮提取液，回收溶劑得到浸膏94 g。將浸膏與同等質(zhì)量的硅膠（80～100 目）拌樣后，進(jìn)行柱層析，以用石油醚（PE）-乙酸乙酯（EA）（10∶0→6∶4）梯度洗脫，合并餾分得到PR1-PR16 共16 個(gè)組分。

PR2 經(jīng)（PE-EA 100∶1～0∶100）柱色譜得到10 個(gè)組分，組分2-2 得到化合物11，組分2-5 經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物4。PR4 經(jīng)（PEEA 50∶1～1∶1）柱色譜得到13 個(gè)組分，組分4-6 經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物12。PR6 經(jīng)（PEEA 30∶1～1∶1）柱色譜分離得到5 個(gè)組分，組分6-3 經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物2。PR8 經(jīng)（PE-EA 30∶1～1∶1）柱色譜得到Fr.1-8 以及Fr.1′-8′16 個(gè)組分，組分8-4 和8′-7 經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物1 和3。PR9 經(jīng)（PE-EA 50∶1～1∶1）柱色譜得到8 個(gè)組分，組分9-2，9-5，9-6 經(jīng)以及反復(fù)凝膠柱色譜純化得到化合物5，6 和7。PR13 經(jīng)（PE-EA 50∶1～1∶1）柱色譜得到10 個(gè)組分，組分13-5，13-10 經(jīng)凝膠柱色譜得到化合物8，9。PR15 經(jīng)（PE-EA 25∶1～1∶1）柱色譜得到12 個(gè)組分，組分15-8 經(jīng)凝膠柱色譜洗脫劑為純甲醇，進(jìn)行洗脫，進(jìn)一步經(jīng)高效制備薄層層析硅膠G 板制備，展開劑為氯仿：丙酮15∶1，得到 5 個(gè)條帶，對(duì)條帶4 進(jìn)行刮板，甲醇洗脫，得到餾分再次進(jìn)行制備薄層層析，得到化合物10。

1.3.2 抗腫瘤活性篩選方法A549、MCF-7/S 細(xì)胞接種于含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，SKOV-3 細(xì)胞接種于含10%FBS 的McCoy’s 5A 培養(yǎng)液中，均在37 ℃，95%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d 傳代一次，調(diào)整細(xì)胞濃度不超過6×104/mL，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用MTT 法檢測(cè)化合物對(duì)A549、MCF-7/S、SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、MCF-7/S、SKOV-3 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104/mL，加入96 孔培養(yǎng)板（使其終濃度為6×103/100 μL），接種細(xì)胞之后靜置1 h 再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（避免96 孔板的邊緣效應(yīng)）。24 h 細(xì)胞貼壁之后再加化合物使其終濃度為200，100，50，25，5 μM，并設(shè)陽性、陰性、空白及DMSO 對(duì)照孔，在37 ℃，95%濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h 后加入MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，以570 nm、630 nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)OD 值。按公式計(jì)算不同濃度的OD 值均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，再計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 化合物波譜數(shù)據(jù)

化合物1：棕色固體，分子式為C15H13O3。MW：240；ESI-MS：m/z241[M+H]+，1HNMR[（CD3）2CO，600 MHz]：6.93（1H，d，J=2.4，H-1），6.84（1H，d，J=2.4，H-3），9.42（1H，d，J=9.2，H-5），7.18（1H，d，J=9.2，2.8，H-6），7.26（1H，d，J=2.8，H-8），7.51（1H，d，J=8.9，H-9），7.56（1H，d，J=8.9，H-10），4.07（3H，s，4-OCH3）；13CNMR [（CD3）2CO，150 MHz]：104.7（d，C-1），155.2（s，C-2），99.5（d，C-3），159.4（s，C-4），111.4（s，C-4a），124.2（s，C-4b），129.0（d，C-5），116.3（d，C-6），154.3（s，C-7），111.4（d，C-8），133.5（s，C-8a），127.4（d，C-9），126.9（d，C-10），134.7（s，C-10a），55.3（q，4-OCH3）[4～6]。

化合物2：褐色固體，分子式為C16H16O5。MW：289；ESI-MS：m/z289[M+H]+；1HNMR[（CD3）2CO，600 MHz]：δ7.91（2H，d，J=7.2，H-2，6），6.91（2H，d，J=7.2，H-3，5），4.72（1H，m），4.07（2H，t，J=9.2，H-9），6.65（1H，s，H-2′），6.67（1H，s，H-4′），6.92（1H，s，H-6′），3.72（3H，s，3′-OCH3）；13CNMR [（CD3）2CO，150 MHz]：δ128.2（s，C-1），131.8（d，C-2），115.2（d，C-3），161.7（s，C-4），115.1（d，C-5），131.8（d，C-6），197.0（s，C-7），54.4（d，C-8），60.0（t，C-9），129.0（s，C-1′），119.5（d，C-2′），147.2（s，C-3′），115.1（d，C-4′），147.2（s，C-5′），112.6（d，C-6′），55.4（q，3′-OCH3）[7]。

化合物3：黑色固體，分子式為C15H14O3。MW：242；ESI-MS：m/z243 [M+H]+；1HNMR[（CD3）2CO，600 MHz]：7.83（1H，s，H-5），6.68（1H，s，H-1），6.46（1H，s，H-8），6.38（1H，s，H-3），3.83（3H，s，7-OCH3），3.78（3H，s，4-OCH3），2.64（4H，m，H-9，H-10）；13CNMR [（CD3）2CO，150 MHz]：106.2（d，C-1），158.6（s，C-2），98.3（d，C-3），155.0（s，C-4），115.2（s，C-4a），124.9（s，C-4b），129.7（d，C-5），113.2（d，C-6），155.1（s，C-7），114.7（d，C-8），139.2（s，C-8a），30.5（t，C-9），29.9（t，C-10），140.4（s，C-10a），55.5（q，2-OCH3）[8]。

化合物4：褐色固體，分子式為C16H14O3。MW：254；ESI-MS：m/z255[M+H]+，1HNMR[（CD3）2CO，600 MHz]：6.94（1H，d，J=2.0，H-1），6.84（1H，d，J=2.0，H-3），9.43（1H，d，J=9.3，H-5），7.20（1H，d，J=9.2，2.7，H-6），7.33（1H，d，J=2.7，H-8），7.65（1H，d，J=8.8，H-9），7.56（1H，d，J=8.9，H-10），4.12（3H，s，4-OCH3），3.90（3H，s，7-OCH3）；13CNMR [（CD3）2CO，150 MHz]：104.7（d，C-1），1556.7（s，C-2），99.5（d，C-3），159.5（s，C-4），114.6（s，C-4a），124.9（s，C-4b），129.0（d，C-5），116.1（d，C-6），156.7（s，C-7），109.0（d，C-8），134.7（s，C-8a），129.0（d，C-9），127.7（d，C-10），134.7（s，C-10a），55.1（q，4-OCH3），54.6（q，7-OCH3）[9]。

化合物5：黃色油狀物，分子式為 C30H48O3。MW：456；15% H2SO4乙醇顯色為紫紅色，與熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC 對(duì)照，在多種溶劑系統(tǒng)中Rf 值均相同。且1HNMR，13C NMR 數(shù)據(jù)與熊果酸基本一致。

化合物6：粉紅色針晶，分子式為C29H50O。MW：414；15% H2SO4乙醇顯色為紫紅色，與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TLC 對(duì)照，在多種溶劑系統(tǒng)中Rf 值均相同。且1HNMR，13C NMR 數(shù)據(jù)與β-谷甾醇基本一致。

化合物7：褐色固體，分子式為C16H16O3。MW：256；ESI-MS：m/z255[M-H]+，1HNMR[CD3OD，600 MHz]：6.32（1H，d，J=2.4，H-1），6.41（1H，d，J=2.4，H-3），8.09（1H，d，J=9.0，H-5），6.73（1H，d，J=9.2，2.4，H-6），6.46（1H，d，J=2.4，H-8），3.91（3H，s，4-OCH3），3.84（3H，s，7-OCH3），2.65（4H，m，H-9，H-10）；13CNMR [CD3OD，150 MHz]：106.9（d，C-1），156.2（s，C-2），97.9（d，C-3），157.8（s，C-4），114.3（s，C-4a），125.8（s，C-4b），128.5（d，C-5），110.6（d，C-6），157.4（s，C-7），112.3（d，C-8），139.0（s，C-8a），29.8（t，C-9），30.3（t，C-10），140.5（s，C-10a），55.0（q，4-OCH3），54.2（q，7-OCH3）[10]。

化合物8：褐色固體，分子式為 C14H10O2。MW：210；ESI-MS：m/z211[M+H]+，1HNMR（CD3OD，600 MHz）：7.72（2H，d，J=8.8，H-2，2′），6.92（2H，d，J=8.8，H-3，3′），7.13（1H，s，H-6），7.56（2H，t，J=7.2，H-7，11），7.23（2H，m，H-9，10）[11]。

化合物9：褐色顆粒物，分子式為C15H12O3。MW：238；ESI-MS：m/z239[M+H]+，1HNMR（CD3OD，600 MHz）：7.02（1H，d，J=2.4，H-1），7.03（1H，d，J=2.4，H-3），9.50（1H，d，J=9.3，H-5），7.09（1H，d，J=9.3，2.8，H-6），7.13（1H，d，J=2.8，H-8），7.33（1H，d，J=9.1，H-9），7.14（1H，d，J=9.1，H-10），4.13（3H，s，4-OCH3）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）：110.7（d，C-1），153.2（s，C-2），98.9（d，C-3），159.1（s，C-4），115.6（s，C-4a），124.3（s，C-4b），129.1（d，C-5），115.7（d，C-6），153.9（s，C-7），110.1（d，C-8），133.1（s，C-8a），127.0（d，C-9），124.5（d，C-10），134.0（s，C-10a），54.6（q，7-OCH3）[12]。

化合物10：淺褐色固體，分子式為C15H14O3。MW：240；ESI-MS：m/z241[M+H]+，1HNMR（CD3OD，600 MHz）：6.29（1H，d，J=2.4，H-1），6.20（1H，d，J=2.4，H-3），7.89（1H，d，J=8.4，H-5），6.51（1H，d，J=8.4，H-6），6.50（1H，s，H-8），2.52（4H，s，H-9，H-10），3.81（3H，s，4-OCH3）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）：106.9（d，C-1），157.7（s，C-2），97.9（d，C-3），156.0（s，C-4），113.6（s，C-4a），124.8（s，C-4b），128.6（d，C-5），112.1（d，C-6），154.6（s，C-7），113.6（d，C-8），139.0（s，C-8a），29.8（t，C-9），30.3（t，C-10），140.4（s，C-10a），54.5（q，4-OCH3）[13]。

化合物11：淺黃色固體，分子式為C28H58O。MW：411；ESI-MS：m/z 392[M-H2O]+，1HNMR（CD3OD，600 MHz）：0.81（3H，t，J=6.7，H-28），3.21（2H，m，J=6.7，H-1）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）：62.7（t，C-1），32.7（t，C-2），25.6（t，C-3），29.2（m，C-4～26），22.6（m，C-27），13.9（m，C-28）[14]。

化合物12：棕色固體，分子式為.MF：C8H8O3，MW：152；ESI-MS：m/z153[M+H]+，1HNMR（CD3OD，600 MHz）：9.66（1H，s，-CHO），7.76（1H，d，J=8.3，H-2，6），6.90（1H，d，J=8.3，H-3，5），3.87（3H，s，4-OCH3）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）：129.3（d，C-1），131.9（s，C-2，6），114.9（d，C-3，5），164.5（s，C-4），191.5（d，1-CHO），55.0（q，4-OCH3）[15]。

2.2 化合物1～5 抗腫瘤活性篩選結(jié)果

對(duì)化合物1～5 進(jìn)行了人體肺癌細(xì)胞株（A549）、人體乳腺癌藥物敏感細(xì)胞株（MCF-7/S）、人體卵巢癌細(xì)胞株（SKOV-3）抑制活性，見表1。

表1 化合物1～5 對(duì)3 種細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性IC50（μM）Tab.1 Cytotoxic activities of compounds 1～5 on three cell lines IC50（μM）

3 討論

從獨(dú)蒜蘭藥用植物分離鑒定得到12 個(gè)化合物，分別為4-methoxy-2，7-dihydroxyphenanthrene（1）、（8R）-4，5'-dihydroxy-8-hydroxyl-methyl -3'-methoxy deoxybenzoin（2）、4，7-dihydroxy-2-methoxy-9，10-dihydrophenan--threne（3）、2-hydroxy-4，7-dimethoxy-phenanthrene（4）、Ursolic acid（5）、β-sitosterol（6）、2-hydroxy-4，7-dimethoxy-9，10-dihydrophenanthrene（7）、4-（Benzofuranyl）-phenol（8）、Flavanthrinin（9）、Coelonin（10）、CH3（CH2）27OH（11）and 4-dimethoxy benzaldehyde（12），化合物1～5 抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果表明對(duì)SKOV-3 細(xì)胞株顯示了較好的抑制活性?；衔?，5，8，11 為首次從本植物中分離得到，2 對(duì)SKOV-3 細(xì)胞株IC50分別為12.79 μM。

獨(dú)蒜蘭[16]（Pleione bulbocodioides）為多年生草本，郝崗平[17]等研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物能顯著抑制 K562 和 HL-60 細(xì)胞的活力和增殖。近年來，國內(nèi)學(xué)者[18?19]對(duì)該植物進(jìn)行化學(xué)成分研究，為獨(dú)蒜蘭的開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。