HCV 復(fù)方制劑防治對(duì)蝦弧菌病藥效學(xué)研究

朱宇嘉，朱志東，董碧蓮，蔡延渠，辛年香，朱盛山

（1.廣州市普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510653；2.廣東藥科大學(xué)中藥開發(fā)研究所，廣東 廣州 510006）

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）2016 年的報(bào)告[1]，2015 年全球?qū)ξr總產(chǎn)量達(dá)到691.5 萬t，產(chǎn)值約500 億美元。FAO 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2]，由于病害，目前全球?qū)ξr養(yǎng)殖成功率不足30%。

近年來，對(duì)蝦弧菌病多發(fā)，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)造成較大影響。對(duì)蝦弧菌病即弧菌感染引起的傳染性疾病，我國對(duì)蝦養(yǎng)殖常見致病性弧菌包括：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, V.p）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi, V.h）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, V.a）等?；【≈饕Y狀包括：對(duì)蝦活力不足、游塘、吃料能力下降；蝦塘可見白便、死亡；體表觀察可見：肌肉白濁、空腸空胃、腸道發(fā)紅等；解剖觀察可見：肝胰腺萎縮、褪色、表層腐爛、白膜消失等?；【【哂泻軓?qiáng)的傳染性，感染率可達(dá)100%，發(fā)病嚴(yán)重的蝦池死亡率可達(dá)90%以上。2019 年，國際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在報(bào)告中，列舉了包括抗生素、微生物制劑等熱門藥品，但無一能有效防治弧菌病。文獻(xiàn)[3]采用抗生素、蛭弧菌等藥品，在實(shí)驗(yàn)室中開展治療弧菌病試驗(yàn)，取得一定的效果，但在實(shí)際應(yīng)用中效果不佳。目前全球尚無有效防治弧菌病的藥物。HCV 復(fù)方制劑（以下簡稱HCV）系中草藥提取物，成分包括半邊蓮花、土香薷、檵木葉等8 種植物。現(xiàn)通過臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證HCV 在養(yǎng)殖環(huán)境中防治弧菌病的藥效。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

時(shí)間為2019 年8 月13 日—10 月27 日。試驗(yàn)地位于廣東省江門市。選擇14 口土塘（1＃—14＃），均為矩形，單個(gè)塘面積均為（7 337±1 334）m2，水深均為（1.2±0.2）m。設(shè)置1＃和2＃為空白組，3?！?4＃為用藥組。根據(jù)使用HCV 節(jié)點(diǎn)的不同，用藥組又分為全程預(yù)防組（3?！?＃）、早用藥組（7?！?0＃）和晚用藥組（11＃—14＃），每組各4 口塘。蝦塘基礎(chǔ)數(shù)據(jù)見表1，所有數(shù)據(jù)于投苗當(dāng)天檢測。

表1 試驗(yàn)蝦塘基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

1.2 材料

試驗(yàn)用HCV 復(fù)方制劑由廣東藥科大學(xué)中藥開發(fā)所制備；凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus Vannamei）蝦苗購自海大集團(tuán)（海興農(nóng)1 號(hào)苗），經(jīng)檢測，桃拉綜合征病毒（TSV）、蝦血細(xì)胞虹彩病毒（SHIV）、蝦黃頭病毒（YHV）、對(duì)蝦白斑病毒（WSV）等均呈陰性；飼料（20 kg/包）購自廣東省陽江正大飼料有限公司。

1.3 弧菌病診斷

診斷依據(jù)主要為3 個(gè)癥狀：肝胰腺內(nèi)有弧菌、吃料能力下降以及出現(xiàn)死蝦。

1.3.1 肝胰腺弧菌檢測

每5 d 檢測1 次對(duì)蝦肝胰腺弧菌，對(duì)病蝦用藥后連續(xù)檢測7 d，每天10：00—11：00（投喂藥料1 h 后）檢測1 次。檢測方法如下：從料臺(tái)隨機(jī)取5 尾腸道飽滿對(duì)蝦，將其放于蒸餾水中游15 min，剝離對(duì)蝦肝胰腺，于蒸餾水中浸泡5 min，后置于干凈器皿中，搗碎，收集至容器，加入0.2% NaCl 溶液至5 mL，搖勻。分別吸取0.05 mL 溶液，滴入5 個(gè)TCBS 培養(yǎng)皿中，涂勻。將培養(yǎng)皿于33 ℃恒溫箱放置18 h，取出觀察，計(jì)算培養(yǎng)皿中菌落數(shù)后，去除菌落數(shù)最多與最少的培養(yǎng)皿，選取剩余3 個(gè)皿的結(jié)果，求平均數(shù)。估算每個(gè)肝胰腺平均菌落數(shù)（即培養(yǎng)皿中菌落數(shù)100 倍），作為檢測結(jié)果。

1.3.2 記錄對(duì)蝦吃料量

養(yǎng)殖過程中，每天分別于06：00、11：00 和16：00投喂1 次。從投苗后第20 d 起，每次投料后，在料臺(tái)留約投喂量1%的飼料，觀察料臺(tái)，如飼料能在1.5 h 內(nèi)吃完，則判斷對(duì)蝦已吃飽；如連續(xù)2 d 投料，對(duì)蝦能在1.5 h 內(nèi)吃完，后一餐加料5%；如連續(xù)3 餐投料1.5 h 未吃完，則記錄蝦塘出現(xiàn)減料現(xiàn)象，并從下一餐起根據(jù)病情減料投喂。

1.3.3 記錄死亡量

對(duì)蝦瀕死時(shí)，喜聚集于增氧機(jī)底部等溶氧量較高的地方。于每日早晚，分別從蝦塘增氧機(jī)底部撈取死蝦，記錄總數(shù)。

1.4 HCV 復(fù)方用藥

1.4.1 全程預(yù)防組

從投苗當(dāng)天開始，按每隔4 d 用藥2 d、1 次/d的方式用藥。10 萬尾蝦用藥量見表2。由投苗量、養(yǎng)殖階段與用藥量關(guān)系，計(jì)算HCV 復(fù)方用量（預(yù)防用量），采用對(duì)蝦30 min 的吃料量拌勻，晾10 min 后，全塘均勻潑灑。

表2 10 萬尾蝦用藥量mL

1.4.2 用藥組

每個(gè)療程均為連續(xù)用藥2 d、早晚各1 次的方式用藥。早用藥組：在對(duì)蝦出現(xiàn)減料現(xiàn)象且肝胰腺內(nèi)檢測出弧菌時(shí)，開始用藥。晚用藥組：即對(duì)蝦出現(xiàn)連續(xù)2 d 死亡量＞5 尾或減料比例＞50%，同時(shí)肝胰腺內(nèi)檢測出弧菌時(shí)，開始用藥。用藥量參照表2。

1.4.3 空白組

空白組不用任何可抑殺弧菌藥物（包括蛭弧菌、抗生素、HCV 復(fù)方等）。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖結(jié)果

空白對(duì)照組2 口蝦塘均持續(xù)出現(xiàn)減料和死亡現(xiàn)象，后因死亡量過大且無法遏制，分別在第40 和48 d 放棄養(yǎng)殖。全程預(yù)防組4 口試驗(yàn)塘中，2 口塘未出現(xiàn)病情，2 口塘出現(xiàn)1 次減料現(xiàn)象。早用藥組中，4 口試驗(yàn)塘均出現(xiàn)過不同程度的減料現(xiàn)象，其中2 口塘出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。晚用藥組中，4 口試驗(yàn)塘均出現(xiàn)死亡、減料現(xiàn)象。試驗(yàn)塘養(yǎng)殖結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)池塘養(yǎng)殖結(jié)果

2.2 死亡量和吃料率

對(duì)蝦吃料率，即對(duì)蝦發(fā)病后用藥前一餐（1.5 h）吃料量占病前7 d 內(nèi)最大吃料量的比例。

2.2.1 空白組

空白組吃料率下降到80%以下當(dāng)天，記錄為d0，記錄d0 到d6（d0 后第6 天）死亡量和吃料率數(shù)據(jù)，見圖1（a）（b）。

圖1 空白組死亡量和吃料率

2.2.2 全程預(yù)防組

因全程未出現(xiàn)連續(xù)3 d 死亡且單日死亡量≥5尾現(xiàn)象，全程預(yù)防組死亡量未記錄。全程預(yù)防組中，2口蝦塘未出現(xiàn)減料現(xiàn)象，2 口塘出現(xiàn)。出現(xiàn)減料現(xiàn)象的池塘，第1 次用藥當(dāng)天記為d0，d0 至d6（d0 后第6 天）吃料率記錄見圖2。

圖2 全程預(yù)防組用藥后吃料率

2.2.3 早用藥組

因全程未出現(xiàn)連續(xù)3 d 有死亡且單日死亡量≥5 尾現(xiàn)象，早用藥組死亡量未記錄。早用藥組4 口蝦塘均出現(xiàn)減料現(xiàn)象，以第1 次用藥當(dāng)天為d0，d0至d6（d0 后第6 天）吃料率見圖3。

圖3 早用藥組吃料率

2.2.4 晚用藥組

以第1 次用藥當(dāng)天為d0，晚用藥組d0 至d6（d0 后第6 天）死亡量、吃料率記錄見圖4（a）（b）。

圖4 晚用藥組死亡量、吃料率變化

2.3 肝胰腺弧菌量檢測

4 個(gè)試驗(yàn)組肝胰腺弧菌量檢測結(jié)果見圖5。圖5 所示數(shù)值為各組蝦塘當(dāng)天弧菌量平均值。全程預(yù)防組中，2 口塘（3#和5#）未出現(xiàn)病情，未用藥治療，故其檢測數(shù)據(jù)未在圖5 中體現(xiàn)。

圖5 用藥前后弧菌量檢測結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白組因病情無法遏制而放棄養(yǎng)殖；全程預(yù)防組基本不受弧菌病影響；治療用藥1 h后，肝胰腺弧菌被抑殺；早用藥組用藥2 d，吃料率回升；晚用藥組用藥后，吃料量上升，但至d6，所有試驗(yàn)塘均未超過病前最高吃料量；晚用藥組d6，死亡現(xiàn)象基本消失。全程預(yù)防組平均產(chǎn)量是早用藥組的1.4 倍、晚用藥組的2.3 倍，早用藥組平均產(chǎn)量是晚用藥組的1.7 倍，可見預(yù)防優(yōu)于治療，應(yīng)及早用藥。

3 討論

3.1 抑菌與弧菌病防治效果對(duì)比

研究[4]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于弧菌病，恩諾沙星、諾氟沙星、氟甲喹等至少需要連續(xù)用藥14 d，才可降低對(duì)蝦死亡率，用藥周期長。而HCV 使用1 次后，對(duì)蝦肝胰腺中弧菌被抑殺，吃料量均超出病前，死亡現(xiàn)象基本消失，相比上述抗生素更具速效優(yōu)勢。蛭弧菌難以作用于發(fā)病部位[5-6]，HCV 用藥1 次后，可抑殺肝胰腺中弧菌，有效性優(yōu)于蛭弧菌。文獻(xiàn)[7]測試了11 種常見植物提取物對(duì)5 種常見弧菌的最小抑菌濃度（MIC）值為5~40 g/L；文獻(xiàn)[8-9]測試厥藻類、石莼MIC 值為1.5 g/L。HCV 是由文獻(xiàn)[7]中NZ 處方及其提取工藝優(yōu)化而來，MIC 為0.25 g/L，遠(yuǎn)低于上述植物提取物。

3.2 藥效可行性

本試驗(yàn)在室外養(yǎng)殖環(huán)境中完成，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與蝦塘養(yǎng)殖環(huán)境主要區(qū)別是：（1）弧菌菌種不一致或致病弧菌并非單一弧菌；（2）養(yǎng)殖環(huán)境包括水質(zhì)、天氣等因素多變且每口塘之間存在差異性；（3）對(duì)蝦健康程度、發(fā)病時(shí)間、療效觀察等存在差異。

FAO、OIE 在報(bào)告[2，10]中指出，目前仍無可防治弧菌病藥物。HCV 在養(yǎng)殖蝦塘試驗(yàn)中，成功防治弧菌病，顯著提高了養(yǎng)殖收益，不僅解決無藥可治這一難題，還為研制防治對(duì)蝦弧菌病中草藥新產(chǎn)品，提供了養(yǎng)殖環(huán)境試驗(yàn)依據(jù)。

3.3 病情復(fù)發(fā)

早用藥組與晚用藥組在用藥治療后，出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)現(xiàn)象，可能是再次感染弧菌。感染源可能來自蝦塘環(huán)境中，尤其是底泥中的弧菌，以及活蝦啃食感染弧菌的死蝦。因此，弧菌病復(fù)發(fā)率高，需加強(qiáng)預(yù)防。