基于葉綠素合成關(guān)鍵基因構(gòu)建馬蹄蓮佛焰苞離體VIGS技術(shù)體系

劉紅艷 楊 拓 王 壹 孫 軒 王 賢 劉振林張國(guó)君 衛(wèi)尊征，

（1河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院/河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省高校特色園藝植物生物育種應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 秦皇島 066000；2北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，北京 100097； 3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193）

馬蹄蓮（Calla lily）是天南星科馬蹄蓮屬（Zantedeschia）的球根花卉，作為主要觀賞部位的佛焰苞形似燃燒的佛焰、狀似彎曲的馬蹄，具有極高的觀賞價(jià)值［1］。然而，馬蹄蓮盛花期后，佛焰花的基部逐漸出現(xiàn)綠色并向上蔓延，在果實(shí)成熟后完全返青［2］，這種現(xiàn)象導(dǎo)致其采后觀賞品質(zhì)下降，經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低。因此，有效解決返青問題，有助于維持馬蹄蓮在運(yùn)輸及銷售過程中的觀賞價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)佛焰苞返青現(xiàn)象的研究，主要集中在生理層面，包括色素含量變化、質(zhì)體發(fā)育以及激素調(diào)控等方面。前人研究表明，馬蹄蓮返青過程中，組織內(nèi)葉綠素含量隨著佛焰苞外表皮綠色程度的加深而逐步增多［3］，且葉綠體作為積累葉綠素的主要場(chǎng)所，在返青過程中再次形成［2］。植物生長(zhǎng)發(fā)育受多種激素調(diào)控［4］，乙烯作用于生長(zhǎng)發(fā)育后期主要調(diào)控衰老，然而研究表明佛焰苞返青的過程不受乙烯調(diào)控［5］；細(xì)胞分裂素和赤霉素主要作用于生長(zhǎng)發(fā)育前期調(diào)控生長(zhǎng)，研究表明外源施用赤霉素能有效延緩返青［6］，與細(xì)胞分裂素有協(xié)同作用［7-8］。綜上可知，目前有關(guān)佛焰苞返青的調(diào)控機(jī)制尚不明晰，有待進(jìn)一步探索。

深入探究佛焰苞返青，需要借助分子手段鑒定相關(guān)的基因功能，從而為后續(xù)基因編輯育種奠定理論基礎(chǔ)。但馬蹄蓮的再生和遺傳轉(zhuǎn)化極其困難［9］，從實(shí)生苗到開花需要3～4 年的時(shí)間，對(duì)佛焰苞進(jìn)行相關(guān)的表型鑒定比較困難。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證馬蹄蓮基因功能的方法仍存在瓶頸。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可引起內(nèi)源mRNA 序列特異性降解［10］。目前VIGS 已成功應(yīng)用在眾多觀賞花卉的相關(guān)研究中，如蝴蝶蘭［11］、長(zhǎng)春花［12］、矮牽牛［13］等。從技術(shù)、材料等方面考慮，利用VIGS 技術(shù)建立馬蹄蓮屬植物基因功能研究的技術(shù)體系，可能是克服馬蹄蓮遺傳轉(zhuǎn)化困難的重要手段。且鑒定葉綠素合成的關(guān)鍵基因，將有助于更好地認(rèn)識(shí)馬蹄蓮佛焰苞的返青過程，為延長(zhǎng)觀賞期提供有力的科學(xué)依據(jù)。

因此，本研究以彩色馬蹄蓮黃色品種Florex Gold為對(duì)象，依據(jù)北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所馬蹄蓮課題組（本課題組）前期所構(gòu)建的佛焰苞返青轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定與葉綠素合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵基因ZhGluTR和ZhChlH轉(zhuǎn)錄本序列，之后進(jìn)一步利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增非結(jié)構(gòu)域的部分編碼區(qū)并基于同源重組法構(gòu)建VIGS瞬時(shí)沉默載體，以期為解析馬蹄蓮佛焰苞返青現(xiàn)象的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為彩色馬蹄蓮黃色栽培品種Florex Gold，栽植于北京市農(nóng)林科學(xué)院延慶農(nóng)場(chǎng)［14］，試驗(yàn)于2022 年3—5 月進(jìn)行。依據(jù)返青過程中外表皮顏色的差異，選擇外表皮呈黃色的盛花期（S1）、外表皮呈淺綠色的返青初期（S2），以及外表皮呈深綠色的返青后期（S3）分別取樣作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 彩色馬蹄蓮返青典型時(shí)期的植物學(xué)性狀觀察 取佛焰苞S1、S2和S3期的新鮮樣本。利用透明膠帶將兩片重疊且濕潤(rùn)的雙面刀片中部粘合，沿佛焰苞中部著色均勻部位的脈絡(luò)垂直方向快速切下，毛筆蘸取置于滴有清水的載玻片上，蓋上蓋玻片完成徒手切片制作，在顯微鏡下觀察比較呈色細(xì)胞的分布［15］。

1.2.2 色素含量測(cè)定 以S1、S2 和S3 期佛焰苞為材料，每個(gè)時(shí)期選取15朵花作為重復(fù)，取樣中部著色均勻部位液氮研磨至粉末狀。稱取0.1 g迅速轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，加入10 mL 提取液，提取液為80%丙酮與95%乙醇的等比混合液。反復(fù)顛倒離心管3～5次，4 ℃避光提取10 min，隨后用MG-1650 臺(tái)式高速離心機(jī)（美瑞克，深圳）7 340 r·min-1離心15 min 后取上清，用UV2500 紫外分光光度計(jì)（天美，上海）測(cè)定663、645 和440 nm 波長(zhǎng)處的吸光值［16］。計(jì)算相應(yīng)的葉綠素和類胡蘿卜素含量［17］。VIGS侵染后的孔片每個(gè)試驗(yàn)組分別選取30片，重復(fù)上述操作。

1.2.3 色差值測(cè)定 以S1、S2和S3期佛焰苞為材料，使用NR60CP 手提式多功能色差儀（三恩馳，深圳）進(jìn)行色差參數(shù)測(cè)定。每個(gè)時(shí)期分別選取15 朵花作為重復(fù)，避開主脈，對(duì)每朵花測(cè)定中部對(duì)稱的2個(gè)位置。將獲取的平均值作為該時(shí)期的花色參數(shù)L*、C和h值（L*值表示亮度，C值表示色飽和度，h值表示色調(diào)角）。VIGS 侵染后的孔片每個(gè)試驗(yàn)組分別選取30 片，重復(fù)上述操作。

1.2.4 基因靶片段克隆與載體構(gòu)建 利用EASY spin Plus 多糖多酚/復(fù)雜植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取返青初期佛焰苞總RNA。使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)RNA 為cDNA作為PCR模板。

本課題組在前期研究中，利用Hiseq2500 平臺(tái)針對(duì)黃色品種Florex Gold 的上述三個(gè)典型時(shí)期的佛焰苞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，原始數(shù)據(jù)登錄在中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所（國(guó)家生物信息中心）的組學(xué)原始數(shù)據(jù)歸檔庫(kù)（Genome Sequence Archive），登錄號(hào)為CRA000209。本研究利用上述數(shù)據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，并從中查找在佛焰苞返青過程中表達(dá)量不斷增加的兩個(gè)葉綠素合成途徑關(guān)鍵基因ZhGluTR（OP076741）和ZhChlH（OP076742）的轉(zhuǎn)錄本序列。通過ORFfinder網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框，將完整的編碼區(qū)輸入CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用Primer 5.0 軟件在非保守結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)設(shè)計(jì)靶片段的上、下游引物擴(kuò)增片段，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和XhoI 得到煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV2）的線性載體，通過同源重組試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）將片段分別與線性TRV2 連接，完成VIGS瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建。擴(kuò)增引物見表1。

表1 本研究所用引物序列相關(guān)信息Table 1 Primer lists and related information used in this study

1.2.5 佛焰苞離體VIGS體系建立 設(shè)計(jì)完全隨機(jī)試驗(yàn)，以佛焰苞中脈為軸，用14 mm打孔器取樣中部及上部孔片作為侵染材料（圖1），分別以3 和5 min 作為真空抽吸時(shí)間，共設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組（5上、5中、3上、3中）進(jìn)行。將病毒載體以及VIGS 瞬時(shí)沉默載體轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，放置28 ℃搖床，加入終濃度50 mg·L-1卡那霉素與25 mg·L-1利福平的液體LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，200 r·min-1中過夜震蕩培養(yǎng)，6 000 r·min-1離心菌液6 min 后棄上清，加入終濃度10 mmol·L-1氯化鎂（MgCl2）、10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）與200 μmol·L-1乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）的侵染緩沖液重懸菌體［18］。調(diào)整菌液在600 nm 波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）濃度為0.8［19］。將TRV1 菌液分別與TRV2、TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH菌液等比混合后暗靜置3～4 h［20］。將中部與上部組織分別浸沒在混合菌液中，抽真空至0.08 MPa［21］，負(fù)壓分別處理3 和5 min 后緩慢放氣，重復(fù)3 次。隨后用蒸餾水反復(fù)沖洗孔片，無菌濾紙吸干水分，將孔片背面向上置于0.4%瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)保持濕潤(rùn)［22］，4 ℃暗置共培養(yǎng)3 d 后轉(zhuǎn)移至21 ℃正常光照下培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)組放置30個(gè)孔片，重復(fù)3次。共培養(yǎng)結(jié)束后記為0 dpi，對(duì)上述4個(gè)試驗(yàn)組在0、3、6、9 dpi 分別取樣品放置于液氮中速凍，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 彩色馬蹄蓮佛焰苞取樣位置示意圖Fig.1 Sampling position diagram on sapthe of Zantedeschia hybrida Florex Gold

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證 完全隨機(jī)試驗(yàn)中選取效果最好的試驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證。上述3 種菌液侵染后的孔片各選10 片，利用EASY spin Plus 多糖多酚/復(fù)雜植物RNA 快速提取試劑盒提取該組樣品總RNA，利用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)為RNA 為cDNA 作為qRT-PCR 的模板。以ZhActin作為內(nèi)參基因［23］，ZhGluTR和ZhChlH作為目的基因，通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。將得到的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計(jì)算［24］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 色差值、色素值以及qRT-PCR 測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖片制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩色馬蹄蓮返青過程中的表型、色差以及相應(yīng)的色素含量及分布情況

通過徒手切片觀察佛焰苞S1、S2和S3時(shí)期的色素分布，并測(cè)定相應(yīng)時(shí)期的色差值和色素含量。

結(jié)果表明，盛花期時(shí)表型為黃色，切片觀察組織背面含有黃色的類胡蘿卜素；返青初期時(shí)表型為淺綠色，切片觀察組織背面開始出現(xiàn)葉綠素積累；返青后期時(shí)表型為綠色，切片觀察組織背面葉綠素積累增多（圖2）。

圖2 彩色馬蹄蓮Florex Gold返青過程中的表型與相應(yīng)色素分布Fig.2 Changes of spathe phenotype and corresponding pigment distribution of Zantedeschia hybrida Florex Gold

在佛焰苞發(fā)育過程中，h值與總?cè)~綠素含量持續(xù)上升，L*值與C 值持續(xù)下降，且各階段之間差異顯著（P＜0.05）；總類胡蘿卜素含量在S1 至S2 時(shí)顯著下降（P＜0.05），S2至S3時(shí)有所下降，但差異不顯著（圖3）。

圖3 彩色馬蹄蓮Florex Gold返青過程中的花色參數(shù)（A）以及色素含量（B）變化Fig.3 Changes of spathe flower color parameter（A），and pigment content（B）in Zantedeschia hybrida Florex Gold during regreening

2.2 ZhGluTR 和ZhChlH 的結(jié)構(gòu)域分析以及沉默片段的克隆和VIGS瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建

由圖4 可知，ZhGluTR 和ZhChlH 的編碼區(qū)都具有較長(zhǎng)的保守結(jié)構(gòu)域，位于編碼區(qū)非結(jié)構(gòu)域部分的片段被成功克隆，長(zhǎng)度分別為412 和400 bp。通過凝膠電泳確定沉默片段大小，并利用Sanger 測(cè)序確定序列的準(zhǔn)確性。通過同源重組法將TRV2 載體與沉默片段分別相連，通過凝膠電泳確定重組片段大小，并利用Sanger 測(cè)序確定序列的準(zhǔn)確性，成功構(gòu)建了VIGS 瞬時(shí)沉默載體TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH。

圖4 ZhGluTR和ZhChlH結(jié)構(gòu)域分析（A）、沉默片段克?。˙）和VIGS瞬時(shí)沉默載體構(gòu)建（C）Fig.4 Domain analysis of ZhGluTR and ZhChlH （A），silent fragment clones（B）and VIGS transient silencing vector construction（C）

2.3 ZhGluTR 和ZhChlH 基因沉默對(duì)彩色馬蹄蓮佛焰苞的影響

在0、3、6 和9 dpi分別取經(jīng)上述3 種菌液浸染后的孔片，進(jìn)行表型、色差值和色素含量測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照侵染的佛焰苞孔片相比，TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH侵染的佛焰苞孔片返青現(xiàn)象出現(xiàn)得較晚。TRV 侵染的佛焰苞孔片在3 dpi 時(shí)由黃逐漸變綠，出現(xiàn)返青現(xiàn)象，隨后在9 dpi 完全返青。TRV2-ZhChlH侵染的佛焰苞孔片在6 dpi 后出現(xiàn)輕微返青，此時(shí)4種處理方法的色調(diào)角h值與對(duì)照相比均顯著降低（P＜0.05）；TRV2-ZhGluTR侵染的佛焰苞孔片在9 dpi后出現(xiàn)輕微返青，此時(shí)4種處理方法的h值與對(duì)照相比均顯著降低（P＜0.05）。并且h值的變化趨勢(shì)與侵染后孔片的顏色變化相符，即孔片表現(xiàn)綠色程度越深，相應(yīng)的h值越大。

圖5 VIGS侵染后各處理組的表型（A）和色調(diào)角（B）變化Fig.5 Phenotype（A），hue angle（B）of each treatment group after VIGS infection

本試驗(yàn)中被浸染的所有孔片隨時(shí)間增長(zhǎng)而發(fā)生的共同變化為葉綠素含量增多，類胡蘿卜素含量降低。相較而言，兩個(gè)沉默組中葉綠素含量顯著增多的時(shí)間節(jié)點(diǎn)位于對(duì)照之后，類胡蘿卜素含量顯著減少的時(shí)間節(jié)點(diǎn)位于對(duì)照之前。除此以外，4 個(gè)處理組中，對(duì)中部孔片真空侵染5 min 的處理方法使得返青現(xiàn)象出現(xiàn)得最遲，葉綠素含量積累以及類胡蘿卜素減少相對(duì)緩慢（圖6）。

圖6 VIGS侵染后各處理組的色素含量變化Fig.6 Pigment content of each treatment group after VIGS infection

綜上所述，沉默ZhGluTR和ZhChlH會(huì)延遲返青現(xiàn)象，對(duì)中部孔片真空侵染5 min的處理方式延遲返青效果最好，推測(cè)ZhGluTR和ZhChlH可能正向調(diào)控馬蹄蓮中葉綠素的合成。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

選取VIGS 體系中延緩返青效果最好的處理組（5中）進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖7 所示。與對(duì)照相比，TRV2-ZhGluTR和TRV2-ZhChlH侵染的佛焰苞孔片中，ZhGluTR和ZhChlH基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。表明佛焰苞離體VIGS體系構(gòu)建成功。

圖7 VIGS侵染后ZhGluTR（A）和ZhChlH（B）的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.7 Changes of relative expression levels of ZhGluTR（A）and ZhChlHB（B）after VIGS infection

3 討論

在自然界中，植物返青現(xiàn)象并不罕見。除馬蹄蓮?fù)?，還出現(xiàn)于夏橙［25］、蝴蝶蘭［26］、白掌［27］等植物中。前人研究表明，彩色馬蹄蓮黃色品種Best Gold 返青過程中，佛焰苞內(nèi)的質(zhì)體形態(tài)逐步發(fā)生變化，即有色體逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苋~綠體［6］；與此同時(shí)，佛焰苞外緣綠色程度加深、葉綠素含量增多以及類胡蘿卜素含量降低［3］。這與本研究黃色品種Florex Gold 返青過程中的生理變化一致。究其原因，可能是由于黃色品種Florex Gold在盛花期（S1）時(shí)，佛焰苞內(nèi)的質(zhì)體以有色體為主，有色體內(nèi)含有大量類胡蘿卜素，使佛焰苞呈現(xiàn)黃色表型；返青初期（S2）時(shí)，佛焰苞內(nèi)的有色體開始向葉綠體轉(zhuǎn)變，此時(shí)有色體減少，類胡蘿卜素含量降低，葉綠體增加，葉綠素含量升高，使佛焰苞由黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色；返青后期（S3）時(shí)，佛焰苞內(nèi)的質(zhì)體以葉綠體為主，葉綠體內(nèi)含有大量葉綠素，使佛焰苞呈現(xiàn)綠色表型。綜上，本研究結(jié)果從表型方面闡述了佛焰苞返青現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

前人研究表明，彩色馬蹄蓮黃色品種Best Gold 佛焰苞的返青現(xiàn)象開始于S1 期后的2～3 d［3］，這與本研究中黃色品種Florex Gold 佛焰苞離體孔片的返青過程一致。處于S1 期的馬蹄蓮佛焰苞外表皮著色均勻，尚未出現(xiàn)綠色，與S2、S3期相比，葉綠素含量最少。由S1向S2轉(zhuǎn)變的時(shí)期是葉綠素生物合成的關(guān)鍵時(shí)期，以S1期的佛焰苞作為侵染材料，選用葉綠素合成關(guān)鍵基因作為構(gòu)建馬蹄蓮佛焰苞VIGS體系的指示基因，最容易觀測(cè)到沉默后表型顏色的變化情況。理論上沉默后可以暫時(shí)抑制葉綠素的合成與積累，達(dá)到延緩綠色表型出現(xiàn)的效果［28］，本研究所得結(jié)果與理論一致。

VIGS 在園藝植物中被廣泛應(yīng)用，侵染材料常選擇種球和幼苗等植物組織。例如，利用種球作為侵染材料的唐菖蒲（Gladiolus hybridus）［29］，以及利用7 周齡幼苗作為侵染材料的罌粟（California poppy）［30］。除上述植物組織外，還可以采用切花甚至瓣片等離體植物組織作為侵染材料。例如，瓜葉菊（Senecio cruentus）采用切花作為浸染材料，通過花葶注射和真空浸潤(rùn)頭狀花序成功沉默花青素途徑基因ScANS使花色改變［28］；玫瑰（Rosa hybrida）采用切花和瓣片作為浸染材料，通過真空法成功沉默與花衰老有關(guān)的基因RhWRKY33，使植株延緩衰老［31］。

采用切花或瓣片進(jìn)行VIGS體系構(gòu)建，相較于種球或幼苗而言，材料更易獲取，并且見效更快，能夠有效避免侵染種球或幼苗后成花過程太久導(dǎo)致的病毒失效問題，同時(shí)便于發(fā)現(xiàn)問題并及時(shí)優(yōu)化體系。前人研究發(fā)現(xiàn)，佛焰苞的切花與瓣片在返青過程中外表皮均由黃轉(zhuǎn)綠，變化趨勢(shì)一致［7］，因此本研究選取了體積更小更易操作的佛焰苞瓣片為試驗(yàn)材料，利用14 mm 打孔器保證取材的均一以及規(guī)整。在同一時(shí)空內(nèi)，植物葉片尖端的衰老先于基部［32］，衰老部位的細(xì)胞分裂和代謝能力較差。彩色馬蹄蓮的佛焰苞本質(zhì)是變態(tài)葉，本研究中對(duì)佛焰苞中部孔片的延緩返青效果高于上部孔片，推測(cè)可能是由于較上部而言，中部組織更幼嫩，細(xì)胞活力更強(qiáng)。在特定范圍內(nèi)，真空條件下侵染植物組織時(shí)間越長(zhǎng)，沉默效果越好。例如，小麥幼苗和玉米幼苗在無真空條件下侵染的沉默效率低于真空條件下侵染的沉默效率［33］。本研究中佛焰苞孔片在真空5 min條件下的侵染效率高于3 min，與上述結(jié)論相符。

本研究驗(yàn)證了彩色馬蹄蓮葉綠素合成關(guān)鍵基因的功能，成功構(gòu)建了馬蹄蓮的離體VIGS 體系，為進(jìn)一步探索彩色馬蹄蓮佛焰苞返青基因的功能提供了技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)彩色馬蹄蓮現(xiàn)有穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟，無法驗(yàn)證基因功能等問題，采用優(yōu)化的試驗(yàn)體系對(duì)葉綠素合成關(guān)鍵基因ZhGluTR和ZhChlH進(jìn)行沉默，構(gòu)建彩色馬蹄蓮佛焰苞離體VIGS 技術(shù)體系；測(cè)定3 種菌液侵染后各個(gè)試驗(yàn)組中孔片的表型、色差值以及色素含量。綜合得出最佳處理方式為對(duì)佛焰苞中部真空處理5 min，即該方式延遲返青的效果最好。