鹽生植物解磷菌的篩選及促生效應研究

李 靜 李明源 張 甜 周 茜 王繼蓮

（喀什大學生命與地理科學學院/新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 喀什 844000）

鹽漬土具有電導率高、水勢低、離子鹽分過多等特點，其惡劣的理化性質使絕大多數(shù)植物難以存活，成為作物生產(chǎn)的最大制約因素之一［1-2］。過去的幾十年里，人類不合理的開發(fā)活動進一步加劇了鹽漬土的形成和土壤次生鹽漬化的發(fā)展趨勢［3］。而土壤養(yǎng)分轉化是鹽漬土植被生長及其生產(chǎn)力的主要限制因素之一［4］，尤其磷素是限制植物生長的第二大營養(yǎng)元素，參與植物的能量轉移、信號轉導及光合作用［5］。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常施用過磷酸鈣等化學磷肥補給磷元素，但施用后的磷肥當季利用率僅有10%～20%［6］，大部分的磷與Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金屬離子結合，形成難溶性磷酸鹽，不易被植物直接吸收利用［7-8］。這不但造成巨大的資源浪費，還導致土壤板結度加重，土壤性質進一步惡化［9］。

解磷菌（phosphate solubilizing microorganisms，PSM）是一類能將難溶性或不溶性的磷酸鹽分解為可溶性磷，以供植物吸收利用的功能微生物。最早的商品化解磷菌制劑是前蘇聯(lián)篩選出的一株巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumvar.phosphaticum，于1947年開始量產(chǎn)應用［10］。國內(nèi)也相繼開發(fā)出了由多種芽孢桿菌組成的復合解磷微生物肥料。目前報道的解磷菌以細菌居多，還包括少數(shù)的解磷真菌及放線菌。解磷菌劑應用至鹽堿土壤可顯著改善土壤性質及結構，促進植株生長，進而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質。如分離自棉花根際的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisQ3 及類芽孢桿菌屬PaenibacillusQ6，能在鹽脅迫下有效定殖于棉花根部，對根冠比產(chǎn)生積極影響［11］；分離自濱海鹽堿地植物根際的芽孢桿菌Bacillussp.T1-8 和T4-9 的接種顯著增加了鹽堿地玉米產(chǎn)量［12］。可見，通過接種解磷菌劑提高植物耐鹽性是一種有效應對土壤鹽漬化的方法。但很多解磷菌對環(huán)境條件存在依賴性，其作用范圍也不同，導致從一個區(qū)域分離的解磷菌株在其他宿主植物或地理區(qū)域不具備普適性。因此，持續(xù)開展PSM 資源的分離篩選依然是開發(fā)增強作物抗逆性微生物肥料的有效手段。

新疆地處歐亞大陸腹地，降雨量少，蒸發(fā)強烈，是我國最干旱、鹽漬化類型最多、土壤積鹽最重的地區(qū)［13］。北部土壤中的鹽以硫酸鹽或氯化物-硫酸鹽為主，伴隨堿化過程；南部土壤以氯化物或硫酸鹽-氯化物為主，南北疆蘇打化土壤均分布廣泛［14］。新疆鹽堿地遍布，其中卻蘊藏著豐富的微生物多樣性，如分離自七角井鹽湖和南湖堿湖土壤中的極端嗜鹽菌多達1 679 株，隸屬于5 門14 個屬［15］；分離自烏爾禾地區(qū)鹽漬土壤中的細菌物種有445 種，分屬于24 個門、126 個目、410 個屬［16］。可見，新疆多樣的耐鹽堿微生物類群為鹽堿土壤改良提供了豐富的菌種資源。而新疆南部的鹽漬化耕地占比遠高于北部，加之干旱少雨，沙塵災害天氣頻繁，是新疆鹽漬化治理的核心區(qū)域［17］。本研究從新疆南部克孜勒蘇柯爾克孜自治州鹽堿地3 種典型鹽生植物中篩選解磷菌，并通過接種至植物驗證其對植株生長及根系發(fā)育的影響，旨在挖掘耐鹽堿的解磷菌種資源，為研制適用于鹽堿地植物促生的微生物肥料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

研究區(qū)位于新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州（76°36′32″E，39°47′58″N），該地區(qū)全年干旱少雨，晝夜溫差大，日照時間長，年均氣溫9.8 ℃，年均降水量33.8 mm，年均蒸發(fā)量近乎降水量的100 倍。土壤pH 值為8.0～8.5，全鹽含量11.9 g·kg-1。植被以鹽節(jié)木（Halocnemum strobilaceum）、鹽穗木（Halostachys caspica）、旱生蘆葦（Phragmites communis）、駱駝刺（Alhagi sparsifolia）、鹽生草（Halogeton glomeratus）等耐鹽堿植物為主［18］。2021年10月，采集該地區(qū)蘆葦、鹽穗木、鹽節(jié)木三種植物根系樣本，深挖取出整株根系，抖落與根系附著松散的土壤后封裝于自封袋，于4℃條件下運回實驗室。

盆栽試驗所用土壤采集自未開墾的鹽堿地，pH 值8.41，全鹽含量1.92 g·kg-1，堿解氮、速效鉀和有效磷含量分別為24.52、109.14、16.05 mg·kg-1，全磷含量362.12 mg·kg-1，有機質含量15.10 g·kg-1。

1.2 培養(yǎng)基

解有機磷菌株篩選采用蒙金娜（Mongina）培養(yǎng)基［19］：葡萄糖10 g、（NH4）2SO40.5 g、KCl 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、NaC1 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、CaCO35.0 g、酵母粉0.4 g、瓊脂18 g、卵磷脂0.2 g，加蒸餾水至1 000 mL。

解無機磷菌株篩選采用NBRIP（National Botanical Research Institute′s phosphate）培養(yǎng)基［20］：葡萄糖10 g、Ca3(PO4)25 g、KCl 0.2 g、(NH4)2SO41 g、MnSO4·H2O 0.25 g、MgC12·6H2O 5 g、瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL。

菌種保藏與活化采用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaC1 10 g、瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL。為利于耐鹽堿菌種篩選，培養(yǎng)基pH 值均調節(jié)至8.0～8.5。

1.3 解磷菌的篩選及純化

1.3.1 根際土壤解磷菌 土壤樣品分根際土和土體土，土體土為抖動根系掉落的與根系結合較松散的土壤，根際土為用刷子小心收集的與根表粘附較緊密的土壤。精準稱取1 g 土壤樣品，加入裝有9 mL 無菌生理鹽水的試管中，180 r·min-1振蕩30 min 得到土壤懸液。采用10 倍序列稀釋法對土壤懸液進行適度稀釋，取不同稀釋度的樣品100 μL 分別涂布于Mongina 和NBRIP 平板上，每個梯度重復3 次。28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察并記錄溶磷圈形成情況，挑取能形成明顯溶磷圈的菌落進行劃線純化。

1.3.2 根內(nèi)解磷菌 在超凈工作臺中剪下根系，用無菌水洗根2 次，再用石蠟封堵根上切口，以0.1%的HgCl2消毒5 min 后用無菌水反復沖洗，最后用無菌濾紙吸干根表水分。剪去被石蠟封堵的根系端口，稱取1 g 樣品在無菌研缽中研磨成泥狀，轉至裝有9 mL 無菌水的試管中渦旋2～3 min。取上清進行梯度稀釋并涂布，同上述方法分離、純化根內(nèi)解磷菌株。

1.4 解磷能力測定

采用鉬銻抗比色法繪制磷標準曲線［21］。取陽性菌株以1%接種量分別接種至30 mL 的Mongina 和NBRIP液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d，離心取上清，以鉬銻抗比色法測定有效磷含量，同時測定發(fā)酵液pH值，分析有效磷含量與發(fā)酵液pH值的相關性。

1.5 菌株鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取菌株基因組DNA，以通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16S rRNA 基因序列。PCR 產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Msp Ⅰ和Hae Ⅲ酶切，分析酶切數(shù)據(jù)并挑選代表菌株送由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。測序結果提交EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫比對，選取同源性高的模式菌株序列用MEGA 11.0 軟件以鄰接（Neighbor-Joining）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

1.6 植物促生試驗

以喀什大學生命與地理科學學院植物學實驗室惠贈的哥倫比亞野生型擬南芥和喀什種子公司市售新冬20號小麥為供試植物，分別進行非鹽堿/鹽堿環(huán)境下的盆栽接種試驗。供試菌株為解有機磷和無機磷能力較強的5株菌。

1.6.1 擬南芥接種試驗設計 擬南芥種子經(jīng)1%次氯酸鈉浸泡10 min，去離子水沖洗4～5 次。用無菌牙簽將種子點入裝有基質的育苗盤中，并覆保鮮膜，待擬南芥生長至4 葉期時以灌根方式進行接種。處理組接種供試菌株培養(yǎng)液和滅活培養(yǎng)液，對照（CK）接種等量LB 液體，每個處理3 個重復。供試菌液濃度統(tǒng)一調為108CFU·mL-1，每隔7 d 灌根一次，于光照培養(yǎng)室中25 ℃、光照14 h/黑暗10 h 培養(yǎng)。統(tǒng)一管理30 d 后收獲，分別測量株高、地上干重、根長、根干重等指標，分析接種處理對非鹽堿脅迫下擬南芥生長的影響。

1.6.2 小麥接種試驗設計 將供試鹽堿土與基質按3∶1 的比例混合，高壓滅菌后裝盆待用。小麥種子同樣清毒處理后，挑選大小一致、顆粒飽滿的種子于水瓊脂平板上催芽。挑選芽長一致的種子移栽，每盆栽種9 株，待幼苗長至4～5 cm 時同上述方法接種處理。統(tǒng)一管理30 d 后收獲植株測定相關指標，并采用乙醇浸泡法［22］測定葉綠素含量，評價解磷菌對鹽堿土中小麥的促生效果。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0和Origin 2021軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和繪圖，通過Pearson相關性分析有效磷含量與發(fā)酵液pH值的關系。所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 解磷菌篩選及溶磷能力測定

采用Mongina 和NBRIP 培養(yǎng)基，從蘆葦、鹽穗木、鹽節(jié)木根際、根內(nèi)及土體中共篩選到141 株解磷菌，其中解無機磷菌株100株，解有機磷菌株128株（表1）。分離自鹽穗木的菌株（62 株）數(shù)量約為蘆葦?shù)?.8 倍、鹽節(jié)木的1.4倍，且根際菌株的數(shù)量遠多于根內(nèi)及土體。

表1 溶磷菌株的分離結果Table 1 Isolation results of phosphate-solubilizing strains

由圖1 可知，解有機磷菌株的解磷率介于1.5%～7.6%之間，以MHCB30的解磷率最大，發(fā)酵液pH值介于5.32～7.54 之間。解無機磷菌株的解磷率介于1.1%～4.7%之間，以APCB2的解磷率最大，發(fā)酵液pH值介于4.52～4.85 之間。Pearson 相關性分析表明，菌株的解有機磷能力與發(fā)酵液pH 值無明顯對應關系（R2=0.002 7，P＜0.05）。而解無機磷能力與pH 值呈顯著負相關（R2=0.848 5，P＜0.05），pH 值越小，解磷能力越大。

圖1 pH值與解磷能力相關性Fig.1 Correlation between pH value and phosphorus solubilizing efficiency

2.2 菌株鑒定

141株菌株經(jīng)16S rRNA的限制性片段長度多態(tài)性（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCRRFLP）分析后，共選取32 株進行16S rRNA 基因測序。如圖2 所示，所有菌株分屬8 個屬，以腸桿菌屬（Enterobacter）為絕對優(yōu)勢屬，占總菌數(shù)的46.9%；埃希氏菌屬（Escherichia）有6株，占總菌數(shù)的18.8%；類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）有4株，占總菌數(shù)的12.9%；不動桿菌屬（Acinetobacter）有3株，占總菌數(shù)的9.7%；嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas）及微小桿菌屬（Microbacterium）均有1株，占總菌數(shù)的3.2%。

圖2 解磷菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA gene sequences revealing phosphate-solubilizing strains evolutionary divergence

2.3 解磷菌接種對擬南芥生長的影響

2.3.1 解有機磷菌株對擬南芥生長的影響 將解有機磷能力較強的5 株菌接種擬南芥幼苗，結果發(fā)現(xiàn)（圖3），接種處理明顯增加其株高和地上干重，分別較CK 提高了13.1%～76.2%和12.5%～77.3%。相比而言，接種菌株培養(yǎng)液比滅活的培養(yǎng)液促生作用更強。其中MHCB30 對株高的促進作用最強，而MHSC29 對地上干重的促進作用最強。

圖3 解有機磷菌株對擬南芥的影響Fig.3 Effects of organic phosphate-solubilizing bacteria on the growth of Arabidopsis thaliana

接種滅活的菌株培養(yǎng)液使根長較CK 降低了0.7%～16.2%，但接種處理使根長提高了16.2%～35.3%。接種處理根干重較對照提高了56.3%～213.2%，其中以MHSC29 促進作用最強，但滅活的菌株培養(yǎng)液處理根干重與對照相比無顯著差異（P＞0.05）。總體而言，MHSC29 對擬南芥的促生作用更強。由圖4 可知，接種MHSC29 明顯促進了擬南芥根系發(fā)育，使側根數(shù)量和長度增加。

圖4 解有機磷菌株對擬南芥的促生效果Fig.4 The growth-promoting effects of organic phosphatesolubilizing bacteria on Arabidopsis thaliana

2.3.2 解無機磷菌株對擬南芥生長的影響 由圖5可知，除接種滅活的NHSB2 導致株高較CK 降低18.0%外，其他處理均促進作物株高的增加，提高范圍在2.5%～94.1%之間，以MPCC58 的增幅最大。同樣，接種滅活的MPCC58、NHSB2 使地上干重較CK 降低了1.9%和5.1%，其他處理均提高地上干重，增加范圍為3.2%～126.0%，以MHCB24的增幅最大。

圖5 解無機磷菌株對擬南芥的影響Fig.5 Effects of inorganic phosphate-solubilizing bacteria on the growth of Arabidopsis thaliana

除接種滅活的AHCC44 和MHCB24 使根長較對照降低6.2%和2.3%外，其他處理均增加了根長，增加范圍為2.3%～38.0%，以MPCC58增加效果最強。除接種滅活的AHCC44導致根干重較CK減少25.2%外，其他處理均有積極影響，使根干重較對照增加了16.7%～283.4%，以MHCB24 增幅最大。綜上，MHCB24 的促生效果最明顯。

2.4 解磷菌接種對鹽堿土種植小麥的影響

2.4.1 解有機磷菌株對小麥的影響 由圖6、7 可知，解有機磷菌株明顯增加了鹽堿土中小麥的株高和莖粗，增加范圍分別為2.4%～43.2%和2.3%～53.1%。除接種滅活的MHSC29 和MHSB72 使地上干重較CK降低12.6%和0.6%外，其他處理均使地上干重增加，增加范圍為10.7%～92.3%。多數(shù)滅活處理對葉綠素含量有負影響，但菌株培養(yǎng)液接種處理均使葉綠素含量增加，增加范圍為7.8%～40.5%。MHCC3 對株高、莖粗及葉綠素含量的促進作用最強，而MHSC29 對地上干重的促進作用最強。

圖6 解有機磷菌株對小麥的影響Fig.6 Effects of organic phosphate-solubilizing bacteria on the growth of wheat

圖7 解有機磷菌株對小麥的促生效果Fig.7 The growth-promoting effects of organic phosphatesolubilizing bacteria on wheat

除接種滅活的MHSB72 導致根干重較CK 降低7.3%外，其他處理均有促進作用，較CK增加了12.5%～146.1%。總體而言，MHSC29 和MHCC3 對鹽堿土中小麥的促進效果更優(yōu)。

2.4.2 解無機磷菌株對小麥的影響 由圖8 可知，除接種滅活的MHCB24、MPCC58、NHSB2 和APCB2 使株高較CK 降低5.3%、1.4%、2.2%和2.2%外，其他處理均表現(xiàn)出積極作用，使株高較CK 增加13.3%～32.4%，以APCB2促進作用最強。接種滅活的MHCB24、NHSB2和APCB2 抑制了莖粗，分別較CK 降低2.7%、2.4%和4.1%，其他處理均有促進作用，較CK 增加了5.1%～28.1%。除接種滅活的MPCC58 和APCB2 導致地上干重較CK 降低7.5%和3.5%外，其他處理均有積極影響，使地上干重較CK 增加了2.7%～84.4%，以APCB2增加量最大。同時，接種菌株培養(yǎng)液均明顯提高了葉綠素含量，較CK提高了31.3%～40.2%。

圖8 無機磷菌株對小麥的影響Fig.8 Effects of inorganic phosphate-solubilizing bacteria on the growth of wheat

除接種滅活的MHCB24、MPCC58 和APCB2 使根干重較CK降低14.4%、1.9%和14.2%外，其他處理均有促進作用，增加了2.3%～158.1%。綜合看，APCB2對鹽堿土中小麥生長的促進作用最強。

3 討論

土壤鹽堿化會對植物生長、生理造成嚴重損傷，但鹽堿土中仍活躍著豐富多樣的微生物，在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性中起著核心作用［23］。前人研究表明，鹽堿土壤中微生物類群變異較大，尤以不動桿菌屬（Acinetobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等占主要優(yōu)勢［24-26］。本研究從3 種鹽生植物中篩選到的解磷菌同樣以Enterobacter占絕對優(yōu)勢，進一步證實Enterobacter是鹽堿生境中普遍分布，并可能發(fā)揮重要作用的細菌類群。

目前，已有諸多農(nóng)田土壤耐鹽堿解磷菌的報道，包括Bacillus、Pseudomonas、固氮菌屬（Azotobacter）、Enterobacter、Arthrobacter等［27］。研究證實，解磷菌可通過溶磷及調控根際微生物群落結構來改善土壤性質，促進植物生長［28-31］。本研究中，解無機磷率與培養(yǎng)液pH值呈顯著負相關關系，與以往報道相似［32-34］。目前普遍認為，微生物對無機磷的降解機制主要是通過釋放有機酸（如葡萄糖酸、草酸、檸檬酸等）降低土壤中的pH 值，將難溶性磷酸鹽酸解。有機酸分子還能與磷酸鹽中的金屬離子形成螯合物，從而釋放磷元素，促進植物對磷的吸收利用［35］。由此推測本研究中解無機磷菌株的溶磷過程也與有機酸的產(chǎn)生有關。但不同菌株分泌的有機酸種類及含量不同，導致其解磷能力有所差異。解有機磷菌株的磷含量與培養(yǎng)液pH值無相關性，原因可能是解有機磷菌株多通過所分泌微生物酶的酶解作用增加速效磷含量［36］。研究發(fā)現(xiàn)，利用DNA 合成技術將植酸酶合成基因導入Pseudomonas simiaeWCS4174后，其溶磷效果更優(yōu)［37］；木霉TrichodermaTU-MDU45經(jīng)復合誘變后溶磷量增加了259.1%，對番茄的促生效果更強［38］。因此，基于多種手段選育優(yōu)良菌種，以進一步提高其解磷能力，是制備高效生物磷肥的有效途徑，值得進一步深入研究。

解磷菌株明顯促進了擬南芥幼苗生長，對鹽堿土的小麥也有積極影響，說明其在增強植物抗鹽堿性上具有一定潛力。但不同解磷菌株對宿主植物的響應不同，如泛菌Pantoea cypripediiB19 接種至小麥后，其促生效果［39］與本研究用腸桿菌APCB2 有所差異。究其原因，可能首先是受到自身解磷能力的影響，還可能與其在植物根際的定殖和生物活性有關。因為微生物的定殖受一系列生物環(huán)境因素影響，包括宿主植物種類、土壤類型、根系分泌物、細菌營養(yǎng)型等［40-43］。除此之外，菌株的有效定殖還受到土壤性質、溫濕度、含氧量等非生物因素的影響［44-45］。可見，微生物解磷能力受多種因素綜合影響，導致其對宿主植物的響應不同。

PSM 不僅能通過多種機制促進鹽堿土中植物生長，還能促進鹽堿土的增肥及修復，改良鹽堿土土質［36］。Adnan 等［46］和Singh 等［47］的研究證實，接種解磷微生物增加了鹽堿土壤中的礦質溶解性，提高了土壤養(yǎng)分。本研究僅通過盆栽試驗評價了解磷菌株的生物學效應，后期需進一步分析解磷菌株對土壤理化性質和生物性狀改良的影響，為解磷菌劑改善鹽堿土壤提供更多理論支持。本研究所用解磷菌株具備開發(fā)為鹽堿地微生物肥料的潛能，但尚未開展小區(qū)和大田試驗。雖然本試驗供試土壤是經(jīng)滅菌處理的封閉系統(tǒng)，充分排除了土著微生物群落及其他生物的干擾，但大田中不可控條件導致的供試菌株競爭性不強、時效性低、穩(wěn)定性差等系列共性問題尚未得到有效解決。從而導致很多在實驗室中效果顯著的菌株，難以在開放的自然環(huán)境中發(fā)揮功效，后續(xù)需考察、跟進這些功能菌株的大田應用效果。

目前對耐鹽堿功能微生物的篩選及性能研究較多，但將其應用于鹽堿土改良尚處于初級階段，未得到全面推廣應用?；诖耍蓮囊韵聨追矫婕訌妼δ望}堿解磷菌的研究：（1）持續(xù)開展鹽堿環(huán)境中解磷菌株的分離篩選，或通過基因工程手段構建高效解磷菌，以進一步提升其促生效果。（2）由于解磷菌株可能兼具多種功能，因此應增強對多功能解磷菌的研究，或整合多種功能菌株構建復合菌劑，以最大化應用于鹽堿土。（3）從酶學、分子生物學及菌落生態(tài)學等方面進一步揭示解磷菌株的促生機制，為其應用于鹽堿土改良提供更多理論支持。

4 結論

本試驗從新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州3 種典型鹽生植物根際、根內(nèi)和土體中共篩選出141 株解磷菌，其中解有機磷菌株的溶磷率介于1.5%～7.6%之間，解無機磷菌株的溶磷率介于1.1%～4.7%之間，且無機磷含量與發(fā)酵液pH 值呈顯著負相關。所有菌株隸屬于8 個屬，以Enterobacter占絕對優(yōu)勢。接種解磷菌對非鹽堿脅迫下擬南芥及鹽堿土中的小麥幼苗地上和地下部分有明顯促生作用。