榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲鑒定及根系定殖效果測定

馬耀杰 程開勇 徐秉良 張樹武

摘 要 為了明確甘肅榆中縣溫室大棚黃瓜根結(jié)線蟲種類及根際定殖情況，采用形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定其種類，并室內(nèi)測定和顯微觀察其在根際定殖效果。結(jié)果表明，甘肅榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲不同蟲態(tài)形態(tài)、大小和雌蟲會陰花紋特征等均具有典型南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）形態(tài)特征。基于線粒體COI基因序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定發(fā)現(xiàn)榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲線粒體COI基因序列與已報(bào)道的南方根結(jié)線蟲臺灣株系（KU517167）聚為一類，其相似性為99.75%；根結(jié)線蟲多序列特異位點(diǎn)鑒定發(fā)現(xiàn)其與南方根結(jié)線蟲孟加拉國株系（MN196556）和南方根結(jié)線蟲印度株系（MN728697）聚為一類，相似性分別為100%和96.91%。經(jīng)致病性測定發(fā)現(xiàn)，待接種根結(jié)線蟲2齡幼蟲30 d后其能夠侵染黃瓜根系并形成大量根結(jié)，經(jīng)染色發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗根系組織內(nèi)寄生大量線形蠕蟲、雌蟲和卵囊，且鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)其形態(tài)與田間采集后分離的線蟲形態(tài)一致。綜上可知，引起甘肅省榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲病的病原為南方根結(jié)線蟲。

關(guān)鍵詞 甘肅榆中；根結(jié)線蟲；鑒定；定殖

根結(jié)線蟲（Root-knot nematodes）是一類種類多、寄主范圍廣和危害重的植物寄生線蟲，據(jù)統(tǒng)計(jì)其種類多達(dá)90多種，可侵染3? 000多種植物[1]。據(jù)報(bào)道，在設(shè)施蔬菜栽培中其侵染后可導(dǎo)致減產(chǎn)50%～80%，已成為限制設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙因素之一[2]。根結(jié)線蟲主要以侵染葫蘆科、茄科和十字花科植物等為主[3]，尤其近年來隨著設(shè)施黃瓜栽培面積擴(kuò)大和復(fù)種指數(shù)提高，其危害愈來愈嚴(yán)重，一般可致減產(chǎn)20%～30％，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)70％以上，甚至絕收[4-5]。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中較為常見的根結(jié)線蟲種類有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、北方根結(jié)線蟲（M.hapla）、花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）和爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica），其中以南方根結(jié)線蟲為主[6]。葛俊杰[7]通過形態(tài)學(xué)和同工酶電泳鑒定發(fā)現(xiàn)侵染甘肅榆中縣黃瓜的根結(jié)線蟲種類為南方根結(jié)線蟲與爪哇根結(jié)線蟲混合種群。但是，由于根結(jié)線蟲形態(tài)極其相似，因此，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和同工酶分析很難快速精確鑒定和區(qū)別南方根結(jié)線蟲與爪哇根結(jié)線蟲[8]。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增rDNA-ITS區(qū)能夠快速診斷和鑒別根結(jié)線蟲的不同種[9]，并且相關(guān)特異性位點(diǎn)已應(yīng)用于根結(jié)線蟲種類鑒別，如景曉輝等[10]通過引物＃C2F3/＃1108和MI-F/MI-R建立了適用于幾種根結(jié)線蟲的分子鑒定方法，其中＃C2F3/＃1108可用于區(qū)別南方根結(jié)線蟲或爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲；MI-F/MI-R引物可特異性的區(qū)分南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。但是，有關(guān)利用線粒體COI基因和多序列特異位點(diǎn)鑒定甘肅榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲種類目前尚未見報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)和線粒體COI基因與多序列特異位點(diǎn)相結(jié)合的方法對采集的甘肅榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲種類進(jìn)行鑒定，并通過致病性和定殖等方面測定，旨在明確其種類，為后期防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種為‘超亮116F1，購買于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子有限責(zé)任公司，并種植于溫室中，溫度為25.0? ℃±0.5? ℃，光照為16/8 h，相對濕度為65%。

供試線蟲：2020年10月和2021年5月在甘肅省榆中縣黃瓜溫室大棚采集帶有明顯根結(jié)的黃瓜根系樣品30份，帶回實(shí)驗(yàn)室保存并進(jìn)行分離。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃瓜根結(jié)線蟲分離 挑選帶有明顯根結(jié)的新鮮黃瓜根系樣品，經(jīng)自來水沖洗干凈后置于解剖鏡下，利用挑針挑取白色雌成蟲和卵囊，并將挑取的卵囊放入篩網(wǎng)，置于裝有無菌水的培養(yǎng)皿中，28 ℃孵化3 d后，每隔1 d 收集1次篩網(wǎng)下部無菌水，即獲得2齡幼蟲。參考段玉璽[11]的方法采用“淺盤法”分離雄成蟲。然后將分離的各蟲態(tài)線蟲置于4 ℃保存，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 黃瓜根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定 將收集的雌蟲、2齡幼蟲和雄成蟲各30頭、卵30粒分別置于體式顯微鏡和光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)特征并拍照。利用顯微鏡電腦自帶軟件ZEN blue測量雌蟲、卵、2齡幼蟲和雄成蟲體長和最大體寬，以及雌蟲、2齡幼蟲和雄成蟲口針長度。然后參考劉維志[3]的方法制備雌蟲會陰花紋（圖1）。將從根部解剖獲得的雌蟲置于載玻片，在體式顯微鏡下按圖1的a線切割，并將切取的角質(zhì)膜移至滴有50%乳酸的載玻片，按圖1的b、c線進(jìn)行切割后，將剩余的形態(tài)較完整的角質(zhì)膜移至滴有甘油的載玻片制片鏡檢，在光學(xué)顯微鏡下觀察其會陰花紋背弓、側(cè)線和花紋等形態(tài)特征。

1.2.3 黃瓜根結(jié)線蟲分子生物學(xué)鑒定 從保存的新鮮植物根結(jié)組織中挑取單頭雌蟲，參考萬新龍等[12]方法提取其DNA。參考羅龍輝等[13]方法利用通用引物和特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測，并將檢測合格的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。測序所得序列采用生物學(xué)軟件DNAMAN進(jìn)行拼接后上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，下載對比結(jié)果中相似度較高的序列并基于鄰接法 （Neighbor-joining） 和利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度（bootstrap）均進(jìn)行1? 000次重復(fù)檢驗(yàn)[14]。

1.2.4 黃瓜根結(jié)線蟲回接致病性測定

將大小一致且飽滿健康的黃瓜種子置于鋪有一層經(jīng)無菌水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中催芽。待萌芽后，選取發(fā)芽一致的種子種植于裝有500 mL無菌土的花盆中，共種植12盆，每盆1棵種子。待黃瓜幼苗生長至三葉一心期時(shí)，取其中6盆在其根際土壤3 cm處接種10 mL濃度為500條/mL的2齡幼蟲懸浮液，其余6盆接種等量無菌水作為對照。待接種30 d后，觀察處理和對照植株的發(fā)病情況，以及檢查其發(fā)病癥狀是否與田間發(fā)病癥狀一致，并再次從發(fā)病植株根系分離雌蟲、卵囊、2齡幼蟲和雄成蟲，觀察其形態(tài)是否與溫室采集分離的線蟲形態(tài)一致。

1.2.5 黃瓜根結(jié)線蟲根系定殖作用測定 待接種2齡線蟲30 d后，收集不同處理和對照黃瓜植株的新鮮根系，參考段玉璽[11]方法對其進(jìn)行染色處理，并置于光學(xué)顯微鏡下觀察其在根系定殖情況。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用SPSS 24.0軟件和Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和多重比較（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜根結(jié)線蟲不同蟲態(tài)形態(tài)及雌蟲會陰花紋形態(tài)觀察

結(jié)果表明，從采集的30份樣品中，均分離獲得了線蟲卵、雌雄成蟲，并孵化出大量2齡幼蟲，觀察發(fā)現(xiàn)30份樣品中分離的不同蟲態(tài)線蟲形態(tài)一致。卵無色透明，橢圓形（圖2-A）；2齡幼蟲呈蠕蟲型，體環(huán)小而清晰，辱盤略高于中辱，口針纖細(xì)（圖2-B），尾部透明稍尖（圖2-C）；雌蟲白色透明呈梨形，具有突出的頸，口針纖細(xì)，基部呈卵圓形（圖2-D，2-E）；雄蟲線形，頭冠高圓，口針較粗，尾端較細(xì)，鈍圓（圖2-G，2-H）。參考伏召輝等[18]的研究，初步鑒定為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）。同時(shí)，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，雌蟲會陰花紋均近圓形，背弓較高，頂部較平，近梯形，側(cè)線不明顯，背面和側(cè)面花紋多呈鋸齒狀并有分叉，有少數(shù)線紋且較平滑（圖2-F）。根據(jù)觀察的會陰花紋特征，并參考羅佳等[19]關(guān)于雌蟲會陰花紋的描述，可見30份樣品中雌蟲會陰花紋形態(tài)均與南方根結(jié)線蟲會陰花紋形態(tài)特征一致。

2.2 黃瓜根結(jié)線蟲形態(tài)指標(biāo)測定

研究結(jié)果表明，所檢30頭線蟲的卵、2齡幼蟲、雌蟲、雄成蟲的形態(tài)測量值均與伏召輝等[18]報(bào)道的南方根結(jié)線蟲蟲體形態(tài)測量值一致（表2）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

采用線粒體COI基因通用引物COI-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰完整（圖3-A），經(jīng)測序其片段大小為408 bp，與預(yù)測片段長度一致。然后將所得序列提交至NCBI基因庫中進(jìn)行序列對比，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)所鑒定的黃瓜根結(jié)線蟲GSYZ與已報(bào)道的南方根結(jié)線蟲臺灣株系（M.incognita， KU517167.1）聚為一類，其相似性為99.75%，并且與M.hapla、M.mali、M.javanica等其他不同種線蟲具有明顯差異（圖4-A）。

基于南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有南方根結(jié)線蟲特異性引物擴(kuò)增出完整條帶（圖3-B），經(jīng)測序其片段長度為767 bp，與預(yù)測片段長度一致，但是其他特異性引物均未擴(kuò)增獲得條帶。然后，將南方根結(jié)線蟲特異性引物擴(kuò)增獲得的序列提交至NCBI基因庫中進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)黃瓜根結(jié)線蟲GSYZ與南方根結(jié)線蟲孟加拉國株系（M.incognita， MN196556.1）和印度株系（M.incognita， MN728679.1）聚為一類，其相似性分別為100%和96.91%（圖4-B）。

2.4 黃瓜根結(jié)線蟲回接致病性及根系定殖效果

接種2齡幼蟲30 d后，與對照相比，處理的黃瓜幼苗根系均形成大量根結(jié)（圖5-B），解剖根結(jié)發(fā)現(xiàn)大量雌蟲和卵囊，并經(jīng)組織染色處理發(fā)現(xiàn)發(fā)病組織中有蠕蟲形線蟲（圖5-D）、雌蟲（圖5-E）、卵囊和卵（圖5-F），且其形態(tài)與田間分離的蟲體形態(tài)一致。然而，對照植株根系生長正常，無根結(jié)形成（圖5-A），且根系組織未發(fā)現(xiàn)雌蟲、卵囊和幼蟲等（圖5-C）。

3 討論與結(jié)論

前期伏召輝等[18]基于根結(jié)線蟲口針、2齡幼蟲、雌蟲、雄蟲的形態(tài)特征和測量值及雌蟲會陰花紋的形態(tài)特征分析，將采集自陜西楊凌黃瓜的根結(jié)線蟲鑒定為南方根結(jié)線蟲；龔浩等[20]通過雌蟲會陰花紋形態(tài)特征，將采集自南京的黃瓜根結(jié)線蟲鑒定為南方根結(jié)線蟲。本試驗(yàn)基于根結(jié)線蟲不同蟲態(tài)形態(tài)特征、體長和雌蟲會陰花紋形態(tài)特征等指標(biāo)將采自甘肅榆中縣的黃瓜根結(jié)線蟲初步鑒定為南方根結(jié)線蟲，與前期研究結(jié)果基本一致。但是，由于根結(jié)線蟲形態(tài)極其相似且雌蟲會陰花紋形態(tài)存在種內(nèi)變異等，因此僅僅單一采用形態(tài)學(xué)鑒定難以準(zhǔn)確鑒別其種類[10]。近年來，RFLP、RAPD、SCAR、rDNA-ITS-PCR、AFLP等分子診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲鑒定 [9]。羅龍輝等[13]通過相對保守的rDNA-ITS和COI兩個(gè)位點(diǎn)鑒定了廣州桑園桑樹根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲；章淑玲等[21]通過rDNA-ITS位點(diǎn)和多序列特異性引物擴(kuò)增鑒定了福建黃花倒水蓮根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲；陸秀紅等[22]基于ITS和28S?rDNA D2D3區(qū)兩個(gè)位點(diǎn)鑒定了廣西賀州梔子根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲，但是已有研究表明，采用rDNA-ITS位點(diǎn)能夠區(qū)分多種線蟲種，但難以區(qū)分南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲[23]，以及COI區(qū)段相對保守也難以區(qū)分南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲[9]，故利用rDNA-ITS或COI區(qū)段難以精確區(qū)分根結(jié)線蟲的具體種。相關(guān)研究表明，多序列特異性位點(diǎn)可鑒定和區(qū)分同屬不同種線蟲[24]。本試驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)和線粒體COI基因與多序列特異位點(diǎn)相結(jié)合的方法將采集自甘肅榆中縣溫室大棚黃瓜根結(jié)線蟲鑒定為南方根結(jié)線蟲。劉丹等[25]通過多序列特異性位點(diǎn)將感染內(nèi)蒙古包頭市番茄的根結(jié)線蟲鑒定為南方根結(jié)線蟲；曹業(yè)凡等[26]通過rDNA-ITS片段與多序列特異性位點(diǎn)相結(jié)合方法將侵染四川省蓬溪縣九葉青花椒的根結(jié)線蟲種類鑒定為南方根結(jié)線蟲。

此外，植物線蟲回接試驗(yàn)與染色技術(shù)是研究線蟲致病性和根系定殖效果的有效手段。本試驗(yàn)經(jīng)致病性和染色觀察發(fā)現(xiàn)所鑒定的南方根結(jié)線蟲不僅能夠侵染黃瓜幼苗根系組織，而且能夠有效地定殖、生長發(fā)育和繁殖。綜上所述，將引起甘肅省榆中縣黃瓜根結(jié)線蟲病的病原鑒定為南方根結(jié)線蟲，但是有關(guān)甘肅省其他區(qū)域黃瓜根結(jié)線蟲的種類還有待進(jìn)一步研究。

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Abstract In order to clarify the species of cucumber root-knot nematode in the greenhouses of Yuzhong county in Gansu province， the species was identified by morphology and molecular biology， and its colonization efficiency in rhizosphere was determined and observed by microscope. The results showed that the cucumber root knot nematodes in Yuzhong county of Gansu had the typical morphological characteristics of Meloidogyne incognita according to the nematodes morphology， size and female perineal pattern. The sequence of mitochondrial COI gene of cucumber root-knot nematode from Yuzhong county was identified as one group with Taiwan strain of M.incognita （KU517167）， and the similarity was 99.75% according to the alignment of mitochondrial COI gene sequence and phylogenetic tree construction. The multiple pair of specific sites sequence was clustered with the sequence of Bangladesh strain of M.incognita （MN196556） and Indian strain of M.incognita （MN728697）， and the similarity was 100% and 96.91%， respectively.? The pathogenicity test found that the cucumbers root was infected and formed a large number of root knots at 30 days after inoculation with the juveniles at the second stages of cucumber root-knot nematodes. A large number of linear worms， females and egg masses were parasitized on the tissues of roots after staining. Microscopic observation showed that the morphology of re-isolated nematodes was consistent with the nematodes that collected from the field. Thus， the cucumber root-knot nematodes in Yuzhong county of Gansu province was identified as M.incognita according to the morphological and molecular characteristics.

Key words Yuzhong county? Gansu? province; Root-knot nematode; Identification; Colonization