與辣椒抗TMVL3基因連鎖的分子標(biāo)記的篩選及種質(zhì)資源抗TMV鑒定

陳靈芝 張茹 王蘭蘭 高彥萍

摘 要 以含抗辣椒TMV的L3基因的材料L15為基礎(chǔ)，利用與L3基因連鎖的3個(gè)分子標(biāo)記189D23MF、PMFR11和PMFR21對種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定。對L15、3份感病材料H8/H9/H11×L15 F1、46份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行室內(nèi)人工TMV接種并對其進(jìn)行表型抗性鑒定和RT-PCR檢測。對篩選出的標(biāo)記在F1及BC1P1群體中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：分子標(biāo)記189D23MF在L15和12份辣椒種質(zhì)上均未擴(kuò)增出條帶；SCAR標(biāo)記PMFR11在L15和46份辣椒種質(zhì)上呈現(xiàn)共顯性分離，SCAR標(biāo)記PMFR21為顯性標(biāo)記。通過室內(nèi)人工接種鑒定方式，2份材料L15、H11×L15表現(xiàn)為高抗。H9×L15表現(xiàn)為抗，H8×L15及5份材料A1、A35、A39、A55、L16表現(xiàn)為中抗，11份材料表現(xiàn)為感病，30份材料表現(xiàn)為高感。在F1及BC1P1群體中PCR擴(kuò)增結(jié)果表明SCAR標(biāo)記PMFR21可用于辣椒抗TMV分子標(biāo)記輔助選擇。

關(guān)鍵詞 辣椒；L3基因；分子標(biāo)記；種質(zhì)資源；TMV

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科辣椒屬一年生或多年生植物，在全國多個(gè)省、市、自治區(qū)廣泛栽培[1]。病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的重要因素，常引起辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，落花、落果，對辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[2-3]。目前，世界各地鑒定出侵染辣椒的病毒有45余種，其中煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是威脅辣椒生產(chǎn)的主要病毒[4-5]。TMV在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，尤其易感染煙草、番茄、辣椒等茄科作物[6-11]。煙草花葉病毒很容易通過機(jī)械摩擦和種子傳播。在植物上引起系統(tǒng)性的花葉癥狀，嚴(yán)重危害作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[12-13]。利用人工接種鑒定抗性種質(zhì)資源和選擇抗性單株費(fèi)時(shí)，易受環(huán)境因素如溫度，植株發(fā)育階段的影響，還依靠于病原的可靠性，而且這種鑒定方式，還可能會把病原散播到鄰近地塊的作物上。因此，在抗病毒育種中，利用與抗性基因緊密連鎖的DNA標(biāo)記被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效的方法[14]。

種質(zhì)資源對煙草花葉病毒的侵染反應(yīng)，受抗性基因存在與否的影響。辣椒中存在抗煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的抗性位點(diǎn)L，L位點(diǎn)抗性包括TMV、ToMV（Tomato mosaic virus，番茄花葉病毒）、PaMMoV（Paprika mild mottle virus，甜椒斑駁花葉病毒）和PMMoV（Pepper mild mottle virus，辣椒斑駁花葉病毒）。在這個(gè)位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了5個(gè)等位基因。L0是敏感型，L1抗TMV的P0生理小種，L2抗PaMMV的P0和P1生理小種，并且戰(zhàn)勝了L1的抗性。L3抗PMMoV的P0、P1和P1.2生理小種，并且戰(zhàn)勝了L2的抗性。L4抗PMMoV的P0、P1、P1.2和P1.2.3生理小種，并且戰(zhàn)勝了L3的抗性。L位點(diǎn)的其他等位基因如L1a、L1c和L2b也被鑒定了，這幾個(gè)位點(diǎn)具有不同的溫度敏感性。近來，PMMoV的生理小種P1.2.3.4被鑒定，這個(gè)生理小種剎住了L4的抗性[15-16]。

Tomita等[15]針對辣椒中抗TMV的P1.2生理小種L3基因，開發(fā)了189D23MF分子標(biāo)記。Sugita等[17]和王立浩等[18]開發(fā)了PMFR11和PMFR21。

本研究基于多年辣椒育種積累的一批種質(zhì)資源，開展利用與抗辣椒煙草花葉病毒基因連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行抗病毒種質(zhì)資源的鑒定工作及室內(nèi)人工接種鑒定，旨在為辣椒抗病毒種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材? 料

L15，從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組引進(jìn)。其特性為：植株矮，長勢弱，果實(shí)為小尖錐形，長約2 cm，味辣。3個(gè)感病材料H8、H9、H11和抗病材料 L15雜交1代（F1）單株33個(gè)，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒育種組的種質(zhì)資源46份。H8（P1）和L15（P2）的回交1代（BC1P1）單株 92 株。

1.2 方法

1.2.1 與抗TMV的L3基因連鎖的分子標(biāo)記鑒定 利用已報(bào)道的3對與L3基因連鎖的分子標(biāo)記189D23MF、PMFR11和PMFR21，對辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定（表1）。采用CTAB法提取辣椒DNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測定DNA的質(zhì)量和濃度，并將濃度稀釋至100? ng·μL-1。PCR反應(yīng)體系為：PCR-mix（2×Es Taq Master Mix）10 μL，模板DNA? 1.0 μL，引物（10? μmol·L-1）各0.8 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25? μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5? min；94 ℃變性50? s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2 辣椒種質(zhì)資源的TMV室內(nèi)人工接種鑒定及分子檢測 在辣椒苗4～5片葉時(shí)采取苗期接種鑒定方法對供試材料進(jìn)行抗病性鑒定[19]。采用天根生化科技（北京）有限公司總RNA提取試劑盒提取2個(gè)L15接種單株、6個(gè)其他材料接種單株、1個(gè)接種煙草單株、1個(gè)未接種煙草單株病毒病樣本總RNA，利用 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 對提取的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用 PCR 擴(kuò)增相應(yīng)病毒的序列（表1）。反應(yīng)體系：Mix（ 含 Mg2+，dNTP，buffer，Taq酶 ）12.5? μL，TMV上下游引物各1? μL，模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，4min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。1%瓊脂糖凝膠檢測目的條帶并雙向PCR直接測序。采用生物學(xué)軟件 DNAMAN進(jìn)行核苷酸序列的多重比對。

1.2.3 SCAR標(biāo)記PMFR21的驗(yàn)證 對篩選出的SCAR標(biāo)記PMFR21在H8/H9/H11×L15F1群體（H8×L15F1單株10個(gè)、H9×L15F1單株12個(gè)、H8×L15F1單株11個(gè)）及H8×L15的BC1P1群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。擴(kuò)增體系同“1.2.1”。

2 結(jié)果與分析

2.1 189D23MF的檢測

利用189D23MF在12份辣椒材料和L15上進(jìn)行檢測，結(jié)果這12份辣椒材料和L15均未擴(kuò)增出條帶（圖1）。

2.2 PMFR11和PMFR21的檢測

利用PMFR11在47份材料上（包括L15）進(jìn)行擴(kuò)增，PMFR11在L15上擴(kuò)增出一條約270? bp左右的條帶，在其余的46份材料上擴(kuò)增出約280? bp左右的條帶，PMFR11呈現(xiàn)共顯性標(biāo)記特征，擴(kuò)增出的兩條條帶大小相近（圖2）。

利用PMFR21在47份材料上（包括L15）進(jìn)行擴(kuò)增，PMFR21在L15上擴(kuò)增出一條約200? bp左右的單一條帶，而在其余的46份材料上沒有擴(kuò)增（圖3），PMFR21呈現(xiàn)顯性標(biāo)記特征（圖3）。

2.3 供試材料抗病性鑒定結(jié)果及分子檢測

2.3.1 供試材料抗病性鑒定結(jié)果 利用室內(nèi)人工接種方式，對50份辣椒材料進(jìn)行抗病毒鑒定，L15表現(xiàn)為高抗。3個(gè)感病材料H8/H9/H11與L15的F1代抗性好，21S6：H11×L15表現(xiàn)為高抗，21S5：H9×L15表現(xiàn)為抗，21S4：H8×L15表現(xiàn)為中抗。表明L15可作為抗TMV抗性資源。46份辣椒種質(zhì)中，5份種質(zhì)A1、A35、A39、A55、L16表現(xiàn)為中抗，11份種質(zhì)表現(xiàn)為感病，30份種質(zhì)表現(xiàn)為高感，表明辣椒常規(guī)種質(zhì)中缺乏抗TMV抗性資源（表2、圖4）。

2.3.2 TMV病毒CP基因的PCR擴(kuò)增和測序 對10個(gè)試驗(yàn)單株采集葉片，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的TMV病毒引物進(jìn)行RT-PCR分子檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，7個(gè)單株上擴(kuò)增出目的片段，3個(gè)單株上無目的片段擴(kuò)增。7個(gè)有目的片段擴(kuò)增的單株分別為1個(gè)接種煙草單株、6個(gè)其他材料接種單株，3個(gè)無目的片段擴(kuò)增的單株分別2個(gè)L15接種單株、1個(gè)未接種煙草單株（圖5）。

挑選1、3、8、10擴(kuò)增出的目的條帶進(jìn)行切膠回收測序，序列結(jié)果分析表明這4個(gè)擴(kuò)增片段核苷酸序列相似性為99.8%，與TMV CP基因核苷酸序列同源性均達(dá)到98%以上。

2.4 SCAR標(biāo)記PMFR21在F1及BC1P1群體上的驗(yàn)證

利用PMFR21在96份材料中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠檢測表明，在33個(gè)F1代單株、1個(gè)L15單株P(guān)MFR21均擴(kuò)增出目的條帶，62份甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒育種組的種質(zhì)資源中均未擴(kuò)增（圖6）。

利用PMFR21在96份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠檢測表明，PMFR21在2個(gè)L15單株B2、C6中擴(kuò)增出目的條帶，在2個(gè)H8單株H1、F5中未擴(kuò)增出目的條帶，其余92個(gè)BC1P1單株中，46個(gè)單株中擴(kuò)增出目的條帶，46個(gè)單株中未擴(kuò)增目的條帶，目的條帶的有和無的擴(kuò)增結(jié)果分離比例為1，符合單基因遺傳分離規(guī)律（圖7）。

3 討? 論

L基因發(fā)現(xiàn)于1980年，被廣泛應(yīng)用于抗病毒辣椒的品種選育工作中。L位點(diǎn)的等位基因L1、L2、L3、L4分別在辣椒屬的Capsicum annuum L.（e.g.cv.‘Bruinsma Wonder and ‘Verbeterde Glas）、Capsicum frutescens L.（cv.‘Tabasco）、Capsicum chinense? Jacq.（PI159236）和Capsicum chacoense Hunz.（PI260429）上被鑒定。通過溫室內(nèi)人工接種TMV株系TMV-U1鑒定，L15表現(xiàn)為抗病，葉片僅有輕微的花葉，表現(xiàn)為高抗。因此，L15是一個(gè)可作為TMV抗源的種質(zhì)資源。

本研究中，189D23MF在L15上未擴(kuò)增出條帶，可能是189D23MF L3基因的來源與L15 L3基因來源不同。

PMFR11在抗病和感病材料上分別擴(kuò)增的條帶大小為269 bp和283 bp，抗性條帶和感病條帶大小相近。Martina等[20]使用6%的聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳跑膠，抗性條帶和感病條帶之間的距離較大，分離清楚，這是因?yàn)榫郾０贩直媛矢叩木壒省１驹囼?yàn)使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行跑膠時(shí)，從圖3中可以看出，兩個(gè)條帶分離的比較清楚，而2%的瓊脂糖電泳制備和跑膠更容易，操作更簡單。

筆者從2020-2021年，利用SCAR標(biāo)記PMFR21對甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒育種組的100多份種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，但沒有1份種質(zhì)資源中含有L3基因，表明辣椒常規(guī)材料中極度缺乏抗TMV的抗性基因。本項(xiàng)研究中，利用F1及BC1P1群體結(jié)合室內(nèi)人工接種鑒定，表明SCAR標(biāo)記PMFR21可用于辣椒抗TMV分子標(biāo)記輔助選擇。

L3基因抗TMV的P1.2生理小種，但不抗TMV的P1.2.3生理小種，而L4基因可以克服P1.2.3生理小種，Capsicum chacoense Hunz.（PI260429）含有L4基因，Kim等[21]開發(fā)出與L4基因連鎖的SCAR標(biāo)記LS430，所以利用Capsicum chacoense Hunz.（PI260429），將它作為TMV的抗源，則可為進(jìn)一步創(chuàng)新抗TMV種質(zhì)資源和選育抗TMV品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)? 論

篩選出與辣椒抗TMV? L3基因連鎖的2個(gè)SCAR標(biāo)記PMFR11和PMFR21。PMFR11在L15和46份辣椒種質(zhì)上呈現(xiàn)共顯性分離，SCAR標(biāo)記PMFR21為顯性標(biāo)記。通過室內(nèi)人工接種鑒定方式，含辣椒抗TMV? L3基因的材料L15表現(xiàn)為高抗，可作為辣椒抗TMV資源利用，感病材料與L15的雜交F1代抗性好。在46份辣椒材料中，5份材料表現(xiàn)為中抗，11份材料表現(xiàn)為感病，30份材料表現(xiàn)為高感，表明辣椒普通材料中缺乏TMV抗性基因。對篩選出的SCAR標(biāo)記PMFR21在F1群體及BC1P1群體中進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明SCAR標(biāo)記PMFR21可用于辣椒抗TMV分子標(biāo)記輔助選擇。

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Abstract Based on material L15 which contained peper TMV resistance gene L3 ，and the pepper（Capsicum spp）? germplasm resources were identified by three molecular markers associated with genetic linkage L3 ，which included 189D23MF，PMFR11 and PMFR21. L15，three infected materialsH8/H9/H11×L15 F1 ，and 46 accesions of pepper germplasms were artificially indoors inoculated with MTV， and its henotypic resistance was identificed and detected by RT-PCR.The results showed that marker 189D23MF didnt amplified any bands on L15 and 12 collections.PMFR11 amplified a 270 bp band on L15，280? bp on 46 collections，and resistant and susceptiable band differentiated clearly. PMFR21 amplified a single luminous and specific 200? bp band on L15 ，and there were no such band on 46 collections. L15 was highly resistant to TMV，and its F1 was? resistant and moderately resistant.The common pepper resources were short of resistant TMV genes.In F1 and BC1P1 population，PMFR21 can be efficiently used for marker-assisted selection（MAS）of pepper breeding for resistance to TMV.

Key words Capsicum spp；L3 gene；Marker；Resources；Tobacco mosaic virus