產環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶苦橙內生細菌的分離鑒定

朱國威，李麗芬，傅楠楠，李子院，柴壽海，李海云*

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004；2.廣西桂林鵬宇兄弟柑桔產業(yè)開發(fā)有限責任公司，廣西 桂林 542500）

環(huán)糊精（cylcodextrin，CD）是環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase）通過催化可溶性淀粉得到的不同分子量的環(huán)狀低聚糖[1]，其中基礎環(huán)糊精為α-CD、β-CD 和γ-CD，含有不同的葡萄糖基分子[2-3]。CGTase 是一種能夠通過分子內轉糖基化反應催化淀粉及相關物質合成環(huán)糊精的胞外酶[4-5]，隸屬糖基水解酶[6]，CGTase 是一種多功能酶，可催化4 種不同的反應類型，包括歧化反應、環(huán)化反應、偶合反應和水解反應[7]。其中環(huán)化反應主要功能為催化分子內轉糖基反應，是環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶最基本的特征反應；而偶合反應的作用機理是打開環(huán)糊精的環(huán)，和環(huán)化反應相反，利用部分片段與直鏈麥芽低聚糖相結合；歧化反應又可以打開直鏈麥芽低聚糖，將目的片段和其他受體結合，相互結合共同催動天然產物的轉糖基反應[8]。除生產環(huán)糊精和功能性寡糖，環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶還可以催化糖基化反應，對黃酮類化合物如蘆丁、橙皮苷等黃酮類化合物進行酶法改造，從而改善其理化性質[9]，廣泛應用在農業(yè)、食品工業(yè)、化妝品、藥品等諸多領域。目前獲取CGTase 的途徑為利用產酶菌株直接發(fā)酵[10]、對菌株的目的基因片段克隆表達、利用基因構建技術對目的特殊片段進行改變[11]。Martins 等[12]篩選出產環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶菌株黏瓊脂芽孢桿菌（Bacillusagaradhaerens）酶活力為0.31U/mL。張佳瑜等[13]篩選出產α-CGTase 菌株浸麻類芽孢桿菌（Paenibacillus macerans），并對該菌株基因片段克隆優(yōu)化，酶活力由1.9 U/mL 提升到4.5 U/mL。雷新輝[14]篩選菌株產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）通過基因誘變，酶活力由0.64 U/mL 提升到了5.68 U/mL。

柑橘屬是一種蕓香科植物[15]，果中含有大量黃烷酮、黃酮和多甲氧基黃酮等物質[16]，提取物多用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[17-18]，而苦橙屬于柑橘屬，果內含有豐富橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素等黃酮類化合物[19]，具有抗氧化、抗菌、提高免疫力等多種功效。利用環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶對柑橘黃酮進行糖基化結構修飾有望拓展其應用[20]。研究表明，內生菌不僅獲得了與宿主產生相同或相似產物的能力，還具有產生宿主所不能產生的物質的能力，包括物質代謝、能量代謝和生物轉化[21]。本研究從苦橙內生細菌中分離篩選高產CGTase的菌株，以期為環(huán)糊精的多元化開發(fā)及柑橘黃酮類物質的糖基化結構修飾提供新的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦橙（Citrus aurantium Linn.）：2021 年9 月采摘于廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h蘇橋鎮(zhèn)。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、瓊脂15 g，加水定容至1 L，pH7.1～7.2。

淀粉-碘篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g、瓊脂20 g，水定容至1 L，121 ℃高溫滅菌后，單個平板加入20 mL戈盧布碘液浸泡過夜。

酚酞-甲基橙篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g、K2HPO40.2 g、酵母膏5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、酚酞0.3 g、蛋白胨5 g、甲基橙0.1 g、瓊脂10 g，水定容至1 L，121 ℃高溫滅菌15 min 后添加Na2CO30.2 g。

產酶液體培養(yǎng)基：K2HPO40.2 g、可溶性淀粉10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蛋白胨5 g、Na2CO30.2 g、酵母膏5 g，水定容至1 L，自然pH 值，121 ℃滅菌15 min。

可溶性淀粉、酚酞、甲基橙、蛋白胨、碳酸鈣、瓊脂、氫氧化鈉、酵母膏（均為分析純）：西隴化工有限責任公司；磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、溴甲酚綠（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）、細菌DNA 提取試劑盒：上海生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計（VIS-7220N）：北京瑞利分析儀器有限公司；電泳儀（JY5000）：北京君意東方電泳器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（LRH-150-Z）：珠江韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺（CJ-1SFS）：天津市泰斯特儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R）：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600）：上海天能科技有限公司；PCR擴增儀（2720-Thermal-Cycler）：美國應用生物系統(tǒng)公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S2 型）：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取健康無病蟲害的完整苦橙果實，用清水清洗表皮異物后，將苦橙置于75%乙醇中浸泡1 min，然后用無菌水清洗3 次，吸取100 μL 第3 次清洗液涂布于LB平板培養(yǎng)，檢驗是否消毒徹底，若有菌生長，需重新對材料消毒[22]。將經表面消毒無菌的苦橙果實置于無菌粉碎機中粉粹后過60 目篩，取適量粉碎物按1∶9（g/mL）加入LB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱內振蕩培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液1 mL，用無菌水梯度稀釋至10-2～10-5，各取100 μL 涂布于甲基橙-酚酞培養(yǎng)基表面，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取在紅色背景下出現(xiàn)黃色光圈的菌落在LB 固體培養(yǎng)平板進行多次劃線純化直至獲得純菌落。所得菌株編號后，接種于LB 試管斜面保存。

1.3.2 菌株初篩

將分離純化的苦橙內生細菌接種于LB 培養(yǎng)平板上37 ℃活化12 h，挑取一環(huán)接種于50 mL 產酶液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 得種子液；種子液按4%接種量接種于裝有50 mL 產酶液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 后，4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，取上清液，即為粗酶液，置4 ℃冰箱保存。

制備淀粉-碘、酚酞-甲基橙篩選平板，用打孔器打孔（d=1 cm），并在孔內加入200 μL 粗酶液，置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱反應2 h，觀察變色圈，計算各透明圈直徑/孔徑的比值，挑選比值大的菌株進行產酶復篩。

1.3.3 菌株復篩

1.3.3.1 淀粉水解酶酶活的測定

取10 μL 粗酶液于試管中，加入0.2 mL 0.2 mol/L甘氨酸緩沖液（pH9.0），再加入0.2 mL 0.2%可溶性淀粉溶液，充分振蕩混勻，置于40 ℃恒溫水浴鍋中反應10 min 后，立即加入0.5 mL 0.5 moL/L 醋酸終止反應，最后加入3 mL 0.005%碘液，20 ℃保溫15 min，測定700 nm 波長處吸光度。以不加酶液為對照組，酶活單位定義為使吸光度下降10%所需的酶量[23]。按下列計算淀粉水解酶酶活。

式中：N 為淀粉水解酶酶活，U/mL；A0為對照組的吸光度；A1為樣品組的吸光度；M 為稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 環(huán)化酶酶活的測定

取0.1 mL 粗酶液于干燥試管中，加入0.9 mL 預先用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6）配制的1%可溶性淀粉溶液作為底物，隨后讓底物和粗酶液充分混合均勻，置于50 ℃恒溫水浴激活，反應10 min。分別按下述方法測定α-CGTase、β-CGTase 和γ-CGTase 活性。

加入1.0mL10mol/L 鹽酸，加入1.0 mL 用50 mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1 mmol/L 甲基橙溶液顯色，振蕩混合器振蕩使顯色混合均勻，20 ℃保溫15 min，讓酶促產物和顯色劑充分混合，在505 nm 下測定吸光度，對應標準曲線計算出α-CD 含量并計算酶活[24]。

加入3.5 mL 30 mmol/L NaOH 中斷酶促反應，加入0.5 mL 由5 mmol/L Na2CO3溶液配制的0.02%酚酞顯色，使用振蕩混合器振蕩使顯色混合均勻，20 ℃保溫15 min，讓酶促產物和顯色劑充分混合，在550 nm 下測定吸光度，對應標準曲線計算出β-CD 含量并計算酶活[25]。

加入50μL1.0mol/L 的鹽酸，隨后加入2mL0.2mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.2）和100 μL 5 mmol/L 溴甲酚綠溶液顯色，使用振蕩混合器振蕩使顯色混合均勻，20 ℃保溫15 min，讓酶促產物和顯色劑充分混合，在615 nm下測定吸光度，對應標準曲線計算出γ-CD 含量并計算酶活[26]。

環(huán)糊精標準曲線的繪制：分別稱取α、β、γ-環(huán)糊精標準品各0.5 g，用水溶解定容，配成0.5 mg/mL 環(huán)糊精標準溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL標準溶液用蒸餾水補至1 mL，按照上述方法進行反應，以環(huán)糊精含量為x 軸，吸光度為y 軸分別繪制α-CD、β-CD 和γ-CD 標準曲線。

酶活單位定義為每分鐘產1 μmol 環(huán)糊精所需酶量[27]。

1.3.3.3 菌株生長曲線測定

按照4%接種量，將菌株種子液接種于50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，相隔4 h 在600 檢測波長下測定吸光度制定生長發(fā)育曲線。

1.3.4 菌株鑒定

1.3.4.1 形態(tài)學鑒定

將分離純化后的菌株接種于LB 固體培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察菌落大小、形狀、顏色等形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色觀察細菌的微觀形態(tài)[28]。

1.3.4.2 生理生化試驗

參照文獻[29]方法，對菌株進行淀粉水解、明膠液化、糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖）發(fā)酵試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、H2S 產生試驗等基本生理生化反應試驗。

1.3.4.3 分子生物學鑒定

利用細菌總DNA 提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒依次對菌株進行DNA 提取和擴增，其中引物為27F 和1492R。PCR擴增程序為95 ℃熱變性5 min；94 ℃、40 s；55 ℃、40 s，72 ℃、2 min，循環(huán)40 次；72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中心上進行同源性比對分析，并利用MEGA11 軟件采用鄰接法結合構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株歸屬[30]。

2 結果與分析

2.1 菌株初篩結果

通過篩選平板從苦橙內生細菌中分離純化出4 株內生細菌，菌株編號為KCEB01、KCEB02、KCEB03、KCEB04，菌株淀粉-碘篩選平板顯色結果如圖1 所示。

圖1 苦橙內生細菌淀粉-碘篩選平板褪色結果Fig.1 Results of starch-iodine screening plate of bitter orange endophytes

菌株發(fā)酵產淀粉水解酶，水解淀粉使淀粉無法和碘液進行反應生成藍色背景，光圈越大，所產淀粉水解酶活性越強。如圖1 所示，菌株KCEB01、KCEB02、KCEB03 和KCEB04 光圈大小分別為2.3、2.0、2.4 cm和2.9 cm。菌株酚酞-甲基橙篩選平板顯色結果如圖2 所示。

圖2 苦橙內生細菌酚酞-甲基橙篩選平板褪色結果Fig.2 Results of phenolphthalein-methyl orange screening plate of bitter orange endophytes

如圖2 所示，菌株所產環(huán)糊精能包埋酚酞-甲基橙篩選平板中酚酞而呈現(xiàn)黃色光圈，光圈越大，所產CGTase 酶活性越強。4 株菌株均能通過降解培養(yǎng)基中可溶性淀粉產生環(huán)糊精，利用酚酞能夠在環(huán)糊精的疏水空腔形成無色二價陰離子原理，包合作用形成黃色光圈，菌株KCEB01、KCEB02、KCEB03、KCEB04 光圈分別為1.7、1.5、1.9、2.2 cm。

初篩結果表明所篩的4 株苦橙內生細菌不僅具有水解活性，還具有環(huán)化活性，從而確定4 株菌株均可產CGTase 酶。根據(jù)酚酞-甲基橙篩選平板及淀粉-碘篩選平板光圈，判斷菌株KCEB04 產CGTase 酶活力遠超其他3 株，選擇菌株KCEB04 進行下一步研究。

2.2 復篩結果

2.2.1 環(huán)糊精標準曲線

分別繪制α-CD、β-CD 和γ-CD 的標準曲線，結果如圖3 所示。

圖3 環(huán)糊精標準曲線Fig.3 Standard curve of cyclodextrin

如圖3 所示，在酸性（pH1.1～1.4）條件下，α-CD 能夠包埋甲基橙使其褪色，吸光度隨著α-CD 含量的增加而降低，標準曲線呈線性，R2=0.994 2，回歸方程為y=0.794 7-0.000 2x，可用于測定樣品中α-CD 含量。

在堿性（pH9～10）條件下，β-CD 能夠和酚酞形成包結物，使堿性酚酞褪色，吸光度隨著β-CD 含量的增加而降低，標準曲線呈線性，R2=0.994 3，回歸方程為y=0.737 7-0.000 7x，可用于測定樣品中β-CD 含量。

在酸性（pH4.1）條件下，γ-CD 使溴甲酚綠發(fā)生增色反應，吸光度隨著γ-CD 含量的增加而增加，標準曲線呈線性，R2=0.999 4，回歸方程為y=0.279 5+0.000 2x，可用于測定樣品中γ-CD 含量。

2.2.2 菌株KCEB04 生長曲線

菌株KCEB04 生長曲線見圖4。

圖4 菌株KCEB04 生長曲線Fig.4 Growth curve of strain KCEB04

由圖4 可知，菌體在24 h 結束快速增長的對數(shù)期，開始趨于平穩(wěn)狀態(tài)。在72 h 后菌體開始走向衰亡。

2.2.3 產環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶酶活測定

根據(jù)初篩結果得知，菌株KCEB04 具有環(huán)化活性和水解活性，而環(huán)化活性可作用于淀粉產生α、β、γ-環(huán)糊精，在菌株生長的對數(shù)期（24 h）和穩(wěn)定期（72 h）取樣測定各種酶酶活，結果見表1。

表1 菌株KCEB04 酶活力測定Table 1 Determination of enzyme activity of strain KCEB04

由表1 可知，菌株在對數(shù)期已經產淀粉水解酶及環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶，時間延長到穩(wěn)定期，酶活力一直處于增加狀態(tài)，其中α-CGTase 酶活力最高，酶活力在穩(wěn)定期達到1.65 U/mL，其次為γ-CGTae，酶活力為1.05 U/mL，β-CGTase 酶活力最低，酶活力為0.44 U/mL，而淀粉水解酶在穩(wěn)定期酶活力為5 884.35 U/mL。

2.3 菌株KCEB04 的形態(tài)學及生理生化反應鑒定

菌株KCEB04 菌落形狀及革蘭氏染色如圖5 所示，菌株KCEB04 生理生化特性的測定結果見表2。

表2 菌株生理生化結果Table 2 Biological biochemical results of strains

圖5 菌株形態(tài)學鑒定Fig.5 Morphological identification of strains

由圖5 和表2 可知，菌株KCEB04 分別在篩選培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～12 h，觀察菌落近圓形，顏色呈乳白色，有異味，菌落表面光滑、隆起、黏稠，相鄰菌落容易發(fā)生融合，用接種環(huán)挑取出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，革蘭氏染色為陰性，顯微鏡下菌株形態(tài)為桿狀或短桿狀，根據(jù)菌株的基本形態(tài)學鑒定和菌株特有的生理生化特征，再參考《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，發(fā)現(xiàn)分離出來的菌株KCEBO4 與產酸克雷伯氏菌相似。

2.4 KCEB04 菌株16SrDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

KCEB01、KCEB02、KCEB03 和KCEB04 菌株的DNA特異性擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖如圖6 所示。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。

圖6 菌株特異性條帶Fig.6 Strain specific band

圖7 依據(jù)16S rDNA 基因序列比對構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree construction based on 16S rDNA gene sequence alignment

由圖6 可見，擴增后獲得核酸片段大小約為1500 bp的目的條帶，目的條帶未呈現(xiàn)多帶拖尾現(xiàn)象特異性強。同源性序列比對分析結果表明，菌株KCEB04 的堿基序列和NCBI 基因庫中產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）的16SrDNA 序列同源性高達99%，而菌株KCEB01、KCEB02、KCEB03 與肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因序列同源性相近，結合菌株KCEB04 形態(tài)學和生理生化特征，最終確定菌株KCEB04 為產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。

3 結論

本試驗通過利用酚酞-甲基橙篩選平板以及淀粉-碘篩選平板褪色遠離篩選高產CGTase 的菌株KCEB04 通過形態(tài)、生理生化反應和16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定菌株KCEB04 為產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），該菌株以送往微生物保藏中心進行保藏，保藏編號為CGMCCNO.25392，菌株KCEB04 經過實驗室搖瓶發(fā)酵證實，不僅具有水解酶活還具有環(huán)化酶活，作用于1%的可溶性淀粉，該菌株α-CGTase 酶活為1.65 U/mL、β-CGTase 酶活力為0.44 U/mL、γ-CGTase 酶活力為1.05 U/mL、淀粉水解酶活為5 884.35 U/mL。

自然界中產CGTase 的微生物多為芽孢桿菌屬，包括軟化、環(huán)狀、嗜熱芽孢桿菌等多種微生物，但是大多研究只針對一種環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶研究。本研究對篩選菌株KCEB04 產淀粉水解酶、α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase 進行全面研究，合理并充分開發(fā)菌株產酶能力，為環(huán)糊精的酶法制備以及黃酮類化合物的轉糖基反應提供技術支持，為該菌株的工業(yè)化應用提供理論支撐。