呼吸系統(tǒng)疾病與呼吸道微生態(tài)的研究進展

王靜然，李鵬飛，劉 苗，陶艷琳，劉亞男，朱淑芬

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010017；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院體檢中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

隨著呼吸道微生物檢測方法的進步， 尤其是高 通 量 測 序 技 術 （high-throughput sequencing，NGS）的出現(xiàn)，實現(xiàn)了痰液微生物組學超越單一病原微生物的檢測， 打破了人類對下呼吸道無菌狀態(tài)的認識［1］。 16S rDNA 測序技術證明了下呼吸道存在一個獨特的處于動態(tài)平衡中的微生物群落，并且該微生物群落以一個優(yōu)化的比例維持微生態(tài)平衡，在預防呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮積極作用。呼吸道微生態(tài)處于動態(tài)平衡的狀態(tài)是由Saeedi 等［2］提出的， 認為從呼吸道進入肺內(nèi)的細菌隨后將被迅速清除，使得肺部微生物群處于動態(tài)平衡狀態(tài)，稱為短暫停留不定居 （transient but not resident，TBNR）。 微生物群的多樣性和組成由許多因素決定，包括宿主遺傳因素、宿主免疫力及環(huán)境因素［3］。 近年來，不斷有新的呼吸道菌群檢測方法出現(xiàn)，人們對于呼吸道微生態(tài)有了進一步的認識， 并開始對呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病之間的關系進行深入研究。 許多傳統(tǒng)觀念認為與微生物不相關的呼吸系統(tǒng)疾病現(xiàn)在考慮與不同于健康人肺部微生物“失調(diào)”有關，即微生物組成的不平衡，從而導致機體出現(xiàn)炎癥反應和免疫紊亂［4］。 越來越多的研究通過16S rDNA 測序技術對健康人及呼吸系統(tǒng)疾病患者的痰標本進行呼吸道微生態(tài)的分析， 發(fā)現(xiàn)健康期間和呼吸系統(tǒng)疾病期間的微生物組成存在顯著差異。 肺部微生物群不僅可能影響疾病的易感性或病因，還可能受到疾病活動或治療反應的影響［5］。因此，本文將總結呼吸道菌群的檢測方法以及近年來呼吸道微生態(tài)的研究進展，探討呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的關系，以期對呼吸系統(tǒng)疾病的特異性診斷和治療提供新的思路。

1 呼吸道菌群的檢測方法

1.1 細菌培養(yǎng)及涂片

細菌培養(yǎng)及革蘭染色涂片是檢測呼吸道感染病原體的傳統(tǒng)方式，是一種廉價、方便的實驗室方法［6］，獲取標本的方式包括經(jīng)口自然咳痰、高滲鹽水誘導咳痰、 口咽通氣管或氣管插管通路吸引以及支氣管鏡檢獲得支氣管肺泡灌洗液等。 該項檢查無法避免被口腔微生物污染的可能， 對呼吸道病原菌的診斷存在一定程度的影響。 在獲得標本后必須完善痰液標本質(zhì)量檢測， 保證上皮細胞及白細胞計數(shù)符合標準。對于門診的輕癥患者，完善細菌培養(yǎng)及涂片的可行性不高，對于重癥患者，尤其是對于咳膿痰或痰量明顯增多的住院患者，細菌培養(yǎng)及涂片對疾病的診治至關重要。 對于可疑合并有曲霉菌、 結核分枝桿菌及肺孢子菌等特殊病原體感染患者， 條件允許可行氣管鏡檢查獲取支氣管肺泡灌洗液送檢。 傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術為微生物研究奠定了基礎， 但是其局限性在于無法進行整體微生物群落結構的分析， 并且培養(yǎng)法的敏感性容易受到抗菌藥物的影響， 通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測到的微生物是有限的［7］。

1.2 高通量測序技術

高通量測序為一種價格低廉的大規(guī)模并行測序技術， 可允許同時獨立測序數(shù)千位到數(shù)十億DNA 片段［7］。 包括基于16S rDNA、18S rDNA、ITS等擴增子測序、 宏基因組測序以及全基因組測序等，其在微生態(tài)領域的應用，使呼吸道微生態(tài)的研究更加深入。 其中，16S rDNA 測序技術則是對特定環(huán)境中（疾病或健康狀態(tài)）全部細菌基因組水平的高通量測序，分析其內(nèi)部組成情況，明確該環(huán)境中微生物的種類及豐度［8］，同時，它也可以用作獨立于培養(yǎng)的技術， 發(fā)現(xiàn)常規(guī)技術無法測得的致病菌。 研究發(fā)現(xiàn)，對整個16S rDNA 進行測序比對常見的靶向可變亞區(qū)測序具有更高的分類分辨率，其局限性在于高成本及采樣深度有限，因此，可以通過對擁有高信息量的可變區(qū)進行測序?qū)崿F(xiàn)這一目的［9］。 對于呼吸系統(tǒng)疾病的研究，可以對提取痰液總DNA 的16S rDNA 片段的V3、V4 可變區(qū)進行擴增，構建細菌基因組文庫后測序，進行菌群結構組成、多樣性及差異分析，不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術僅僅針對部分致病菌的檢查。 通過對整個呼吸道微生物進行研究， 分析群落組成變化與疾病發(fā)生發(fā)展之間的關系。 然而，16S rDNA 測序技術對整個呼吸道細菌組成的測定過程中無法識別已經(jīng)死亡的細菌［8］，而呼吸道微生態(tài)是處于動態(tài)平衡中的， 該技術對最終得到的細菌群落的組成存在一定的影響?？傊?，不斷發(fā)展的高通量測序正在徹底改變對微生物的研究。

1.3 熒光顯微鏡成像技術

呼吸道微生物的熒光顯微鏡成像， 是一種基于分子生物學的熒光成像技術， 將細菌通過多種不同的熒光探針進行可視化處理［10］，再利用熒光顯微鏡檢測熒光標記的細菌信號， 從而實現(xiàn)細菌的檢測。 該方法是一種簡單易行、效益高、便攜的微生物檢測方法， 廣泛適用于臨床樣本中的細菌鑒定， 是篩查和診斷各種不同病原菌導致的感染性疾病的基本方法，但是，一般的探針不能有選擇性地識別不同的細菌種類。 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH） 是針對細菌識別的一種常用方法， 允許在屬或種水平上識別目標微生物， 通過特定設計的核酸探針與細菌的DNA 或RNA 特定的區(qū)域發(fā)生特異性結合， 從而實現(xiàn)對目標細菌的特異性熒光染色， 之后對環(huán)境中未標記的細菌進行清洗， 即可得到目標細菌的熒光顯像圖［11-12］。 熒光顯微鏡成像技術，利用其可提供實時和高分辨率的微觀及宏觀信息， 具有快速和準確診斷的優(yōu)點， 逐漸發(fā)展成為醫(yī)療機構內(nèi)診斷的優(yōu)勢工具［13］。

1.4 細菌的光學檢測方法

傅里葉變換紅外光譜 （Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIRS）是一種非侵入性的細菌檢測工具， 可在不使用外源性染料或探針的情況下分析細胞，實現(xiàn)細菌病原體的快速、可靠、廉價和高效鑒定［14］。 它能夠以紅外頻率對整個細菌細胞或其他部分進行生化掃描。 其原理是當樣品暴露于紅外光束時， 分子的振動行為會因傳遞能量量子而改變， 從而影響其振動和旋轉模式［15］。FTIRS 是一種基于提取完整微生物細胞紅外光譜信號相關生化特征的細菌分型方法［16］，用于微生物分型的三種主要紅外光譜取樣模式為透射、漫反射及衰減全反射。 目前已經(jīng)發(fā)表了較多利用FTIRS 快速鑒別微生物的相關報告［17］，包括彎曲芽孢桿菌和嗜麥芽鏈球菌［18］、金黃色葡萄球 菌［19］等均有單獨報道。

生物傳感技術的出現(xiàn)， 為微生物的鑒別提供了快速靈敏的平臺， 包括包含長周期光柵的光纖傳感器［20］及光纖布拉格光柵［21］已被應用于 疾病診斷和環(huán)境檢測領域。 目前已有研究報道表面增強拉 曼 普 光 譜 （surface -enhanced Raman spectroscopy，SERS）用于大腸桿菌的檢測，但是該方法無法獲得更大物種的所有拉曼普光譜帶的完整信息，因此具有一定的局限性［22］。 Kaushik 等［23］利用基于生物功能化二硫化鉬納米片的光纖表面等離子體共振免疫傳感器實現(xiàn)了大腸桿菌的快速檢測， 該項研究使光纖傳感器的靈敏度得到了顯著的改善，但是也存在一定的局限性，包括其高成本及傳感器后期的不穩(wěn)定性。

2 呼吸道微生態(tài)的研究進展

肺組織是呼吸道微生態(tài)研究最理想的標本，但標本的獲取難以實現(xiàn)。 痰液作為呼吸道微生態(tài)研究首選的標本，同樣具有豐富的微生態(tài)信息，并且極易獲得。有研究表明，因呼吸道的解剖學連續(xù)性，健康人群上下呼吸道細菌種類相似，差異僅僅在于細菌的生物量上， 其生物量從上到下呼吸道逐漸減少［24］，因此，可以選擇低侵入性的方法，通過高滲鹽水誘導咳痰獲取標本進行16S rDNA 測序， 明確健康人和不同疾病狀態(tài)下患者呼吸道微生態(tài)的構成， 研究呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病之間的關系。

不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術，Hilty 等［25］于2010年運用16S rDNA 測序技術，首次表明下呼吸道并不是無菌的，其存在一個特征性的微生物群，通過對支氣管哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 患者以及健康對照者呼吸道微生物進行比較發(fā)現(xiàn)， 健康人的上下呼吸道微生物群相似， 而患者的呼吸道細菌群落可能會隨著疾病而改變，因為16S rDNA 測序技術可以檢測到環(huán)境中全部細菌基因組，該結果無法排除操作過程中污染的可能。 Erb-Downward 等［26］的一項針對健康者及COPD 患者支氣管肺泡灌洗液的16S rDNA 測序表明，健康人的肺部同樣存在豐富的微生物群落。由此可見，呼吸道微生物組作為人類基因的組成部分，可保障機體相關代謝的順利進行， 共生菌在抵抗致病菌入侵方面也發(fā)揮積極作用，使呼吸道微環(huán)境處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)［27］。Haldar 等［28］通 過16S rDNA 測 序 技 術 對 健 康 者 及COPD 患者呼吸道整體微生態(tài)進行研究， 表明健康者呼吸道常見的細菌門分別為厚壁菌門、 擬桿菌門和放線菌門，相比之下，在COPD 受試者中，變形菌則是最主要的菌門。 高通量測序技術的出現(xiàn)打破了人類對下呼吸道為無菌狀態(tài)的認識［29］，激發(fā)了人類對于呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展關系的探索。

3 呼吸道微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病

3.1 慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病是一種以持續(xù)氣流受限為特征的常見呼吸系統(tǒng)疾病， 是一項可預防及治療的重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，當其癥狀發(fā)生急性惡化時，稱為慢阻肺急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）［30］。 導 致AECOPD 最常見的誘因為感染， 細菌感染占重要比例［31］。感染使呼吸道微生態(tài)平衡被破壞，加速了機體的炎癥及免疫反應， 從而促使疾病進展，但是， 對于呼吸道微生態(tài)失衡與COPD 之間的因果關系仍然需要進一步研究明確。

在COPD 穩(wěn)定期，呼吸道細菌負荷相對較低，豐度從上呼吸道至下呼吸道呈梯度下降［8］。 目前研究暫時無法明確疾病加重與呼吸道微生態(tài)失衡之間的因果關系，但是可以明確的是，隨著COPD嚴重程度的增加， 其呼吸道菌群的多樣性下降。COPD 患者呼吸道炎癥反應增強以及疾病進展相關的肺部微生物群的變化已經(jīng)得到證實［32］。 Su 等［33］研究發(fā)現(xiàn)， 與穩(wěn)定期COPD 和健康對照組相比，AECOPD 組的呼吸道細菌多樣性 （Shannon 和Simpson 指數(shù)）顯著降低；在AECOPD 組的痰液樣本中發(fā)現(xiàn)的最主要的細菌門是變形桿菌， 占微生物組的30%。與穩(wěn)定期COPD 組相比，AECOPD 組中厚壁菌和擬桿菌的相對豐度降低， 而變形桿菌和放線菌的相對豐度增加。Wang 等［34］對我國漢族人群進行研究得出了相同的結論，AECOPD 組患者較COPD 穩(wěn)定期患者呼吸道微生態(tài)多樣性下降，但該項研究結果無法排除AECOPD 患者長期使用糖皮質(zhì)激素或者抗生素的影響， 同時，AECOPD 的發(fā)生可能與呼吸道微生物多樣性下降和變形桿菌比例增加相關，而流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌屬及銅綠假單胞菌等常見的致病菌均屬于變形菌門。

隨著COPD 病情的進展， 呼吸道微生態(tài)發(fā)生變化，其多樣性下降而豐度增加，共生菌與致病菌比例失衡， 可能是由于致病菌數(shù)量發(fā)生變化所導致，因此發(fā)現(xiàn)豐度增高的致病菌，對慢阻肺急性加重的治療有著重要的臨床意義， 通過對致病菌的針對性治療從而達到氣道微生態(tài)恢復穩(wěn)態(tài)的目的，來延緩COPD 的進展，控制病情。

3.2 哮喘

哮喘是一種影響肺部氣道的慢性疾?。?5］，是肺部最常見的炎癥性疾病， 對全球健康和經(jīng)濟造成了巨大的負擔， 其特征是慢性氣道炎癥及氣道結構重塑，研究表明，在氣道結構變化的基礎上，先天免疫機制與微生物群的相互作用是哮喘發(fā)生的主要原因［36］。 下呼吸道微生物失調(diào)在哮喘的發(fā)病機制中起重要作用，然而，目前對于呼吸道微生態(tài)失調(diào)與呼吸道炎癥之間的因果關系沒有明確闡述。

Marri 等［37］利用16S rDNA 測序技術對輕度活動性哮喘患者和非哮喘受試者誘導痰微生物群落特征進行比較， 發(fā)現(xiàn)所有的痰標本均含有5 個主要的細菌門：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門和擬桿菌門， 前3 個菌門占總序列的90%以上。變形菌門在哮喘患者中比例較高，結果具有統(tǒng)計學意義。相比之下，厚壁菌門和放線菌門在非哮喘受試者中更為常見， 但是該項結果不具有統(tǒng)計學意義，此外，與非哮喘樣本相比，哮喘患者的樣本具有更大的細菌多樣性， 該研究表明了哮喘患者呼吸道細菌的負荷量及多樣性均增加， 這與Hilty 等［25］的研究結果一致。 研究結果表明，呼吸道微生物在哮喘的發(fā)病中起重要作用［38］。 哮喘發(fā)病涉及遠端支氣管， 而這些部位的細菌豐度較上呼吸道明顯降低， 關于呼吸道微生態(tài)失調(diào)與哮喘的發(fā)病機制還需進一步明確。

3.3 肺癌

肺癌是一種發(fā)病率高、死亡率高、生存率低的高負擔疾病，吸煙是肺癌最重要的危險因素［39］，肺癌是癌癥的主要死亡原因［40］。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，肺部微生態(tài)失調(diào)可能通過影響代謝、 炎癥或免疫反應從而在致癌過程中發(fā)揮重要作用［41］，但是，目前微生態(tài)失調(diào)如何導致肺癌發(fā)病機制的問題仍未解決。

Jin 等［42］利用宏基因組學對肺癌患者、非惡性肺部疾病患者及健康受試者的支氣管肺泡灌洗液進行物種水平上的微生物群落特征研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比， 肺癌患者的下呼吸道微生物豐富度顯著降低，但香農(nóng)指數(shù)顯著升高。與健康受試者相比， 非惡性肺部疾病患者的下呼吸道微生物豐富度較低。該實驗表明，肺癌患者下呼吸道微生物種類較健康對照組顯著減少， 但其物種多樣性及均勻性較高。Liu 等［43］利用支氣管鏡防污染毛刷取樣后， 對肺癌患者和健康對照者樣本進行16S rDNA 測序發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，肺癌患者的呼吸道微生物多樣性顯著降低。 該項實驗結果與Jin 等［42］的結果并不一致。 對肺部微生物態(tài)與肺癌之間的關系進行研究， 可以更好地了解肺部微生物在肺癌發(fā)生中的潛在機制， 有利于肺癌的早期診斷，同時為肺癌的個性化治療創(chuàng)造條件。

3.4 特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明的慢性、進行性纖維化間質(zhì)性肺病，是間質(zhì)性肺疾病最常見的類型［44］。間質(zhì)性肺疾病是一組異質(zhì)性疾病， 遺傳及環(huán)境因素之間的相互作用被認為是發(fā)病的主要因素， 然而導致其發(fā)生發(fā)展的機制尚不完全清楚。 目前對IPF的發(fā)病機制了解有限， 盡管已有抗纖維化的藥物可用于臨床，但是患者的預后仍然很差［45］。肺部微生物組可能影響間質(zhì)性肺疾病的發(fā)生及發(fā)展，但是肺部微生態(tài)失調(diào)與疾病發(fā)生發(fā)展的因果關系尚未明確。

O′Dwyer 等［46］進行了一項前瞻性觀察性研究，利用16S rDNA 測序技術對IPF 患者的支氣管肺泡灌洗液進行研究， 發(fā)現(xiàn)進展性IPF 患者的細菌負荷明顯高于非進展性IPF 患者，并且，細菌負荷的增加還與群落組成的顯著差異和群落多樣性喪失有關。 該結果表明可以利用呼吸道細菌負荷預測IPF 患者的疾病進展，但是同樣無法證實細菌負荷增加與IPF 發(fā)生的因果關系。 Invernizzi 等［47］進行的一項前瞻性研究表明， 對受試者的支氣管肺泡灌洗液進行16S rDNA 測序后發(fā)現(xiàn)，IPF 患者下呼吸道微生物群以厚壁菌門占主導地位， 與健康對照者相比，IPF 組厚壁菌門及放線菌門豐度增加且具有統(tǒng)計學意義， 并且IPF 組微生物群落均勻度降低。 該實驗同樣證明了IPF 微生物群落的特點是支氣管肺泡灌洗液中的細菌負荷增加，并且與疾病進展相關， 其程度可以預測IPF 的進展速度和死亡風險。

目前的研究已經(jīng)證明IPF 患者呼吸道細菌負荷可以預測疾病進展， 但尚未明確與疾病進展相關的特定微生物， 并且細菌負荷與疾病發(fā)生發(fā)展之間的因果關系尚未明確［48］。 目前的研究正著力尋找與微生態(tài)相關的IPF 潛在發(fā)病機制， 從而為IPF 的治療提供科學依據(jù)。

3.5 囊性纖維化

囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種常見的常染色體隱性遺傳疾病，病變可累及肺部，肺部的囊性纖維化典型的臨床表現(xiàn)為慢性阻塞性氣道疾病伴有細菌定植， 主要為銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌［49］。慢性感染伴隨氣道炎癥是CF 患者發(fā)病和死亡的主要原因。 目前對于肺部微生態(tài)與CF發(fā)病機制的關系仍存在一定爭議。

在CF 患者中，可以觀察到患者肺部微生物的遷移和消除出現(xiàn)失衡， 并且無論其處于穩(wěn)定期或者加重期， 幾乎所有的年輕患者均可在痰中檢測到特定的呼吸道病原體，例如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等［50］。 Cuthbertson 等［51］對13 個CF 中心299 名患者的痰標本進行高通量測序發(fā)現(xiàn)，隨著肺功能的降低， 微生物多樣性喪失伴隨著優(yōu)勢菌群的增加， 多樣性與優(yōu)勢度之間存在顯著的負相關，其中可見優(yōu)勢菌種銅綠假單胞菌，這與之前的試驗一致［52］。 CF 的一個關鍵挑戰(zhàn)在于如何使用呼吸道微生物態(tài)的信息指導呼吸道慢性感染的臨床管理。 只有了解呼吸道微生物組之間的相互關系及其與宿主的關系才能進一步協(xié)助CF 的治療，為進一步改善CF 患者的生活質(zhì)量提供了希望。

3.6 支氣管擴張

支氣管擴張是一種異質(zhì)性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是氣道的病理性永久性擴張［53］，不同于遺傳性疾病肺囊性纖維化導致，該處支氣管擴張?zhí)刂阜悄倚岳w維化支氣管擴張，目前沒有批準用于支氣管擴張的治療方法［54］。在支氣管擴張患者中，可以觀察到肺部微生態(tài)失衡及微生物負荷增加，同時也檢測到呼吸道病原微生物的定植， 發(fā)現(xiàn)最常見的細菌為銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌［55-56］。目前對于呼吸道微生態(tài)失衡與支氣管擴張發(fā)病機制之間的因果關系尚不明確。

Lee 等［57］根據(jù)病情嚴重程度將63 名支氣管擴張患者分為兩組，利用16S rDNA 測序技術對其痰微生物組進行研究發(fā)現(xiàn)， 兩組患者中常見的細菌門均是變形菌門和厚壁菌門， 兩個研究組在細菌門水平上的相對豐度沒有顯著差異； 而在屬水平上， 輕度支氣管擴張組的嗜血桿菌和羅氏菌屬明顯多于中/重度患者組，而假單胞菌在中/重度患者組更為常見，并且都具有統(tǒng)計學意義。兩組患者痰微生物群落多樣性未見明顯差異。 測序技術的出現(xiàn)， 可以更全面地分析支氣管擴張患者肺部細菌的組成， 對于支氣管擴張患者的慢性感染也有了更進一步的理解，通過對呼吸道微生態(tài)的認識，從而得到如何進行慢性呼吸道感染預防與管理的啟示，延緩疾病的進展。

3.7 肺結核

肺結核是全世界主要的傳染性死亡原因，全世界大約四分之一的人口潛伏感染結核分枝桿菌［58］。 結核分枝桿菌與肺內(nèi)常駐微生物群相互作用，導致肺部微生態(tài)失調(diào)，這可能與肺結核的發(fā)生及發(fā)展相關。 目前對于呼吸道微生態(tài)與肺結核之間的關系知之甚少，相關的研究樣本量比較小，還無法避免口腔微生物污染的可能。

Hu 等［59］利用16S rDNA 測序技術， 通過對163 名痰陰性疑似肺結核患者和12 名結核分枝桿菌陽性患者及其抗結核治療后轉陰的支氣管肺泡灌洗液微生物組的特征分析發(fā)現(xiàn)，70 名患者感染結核分枝桿菌， 痰陰性患者樣本中結核分枝桿菌患病率為42.9%，另外70 名患者根據(jù)肺結核指南診斷，剩余23 名患者為細菌感染導致，與痰陰性患者相比， 痰陽性患者的肺部微生物群落α 多樣性顯著降低， 兩組患者的肺部微生物群落β 多樣性存在顯著差異。 痰陽性患者與抗結核治療痰培養(yǎng)轉陰的支氣管肺泡灌洗液微生物群落特征相比， 經(jīng)過治療后的微生物群落具有更高的α 多樣性。該研究結果提示，支氣管肺泡灌洗液中結核分枝桿菌的存在可能會影響呼吸道微生態(tài)的構成，使其多樣性降低。Hu 等［60］再次利用宏基因組測序技術， 對30 名痰陰性肺結核患者和30 名痰陽性肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液微生物組學特征進行研究發(fā)現(xiàn)， 兩組樣本中均檢測到結核分枝桿菌，在痰陽性組中占優(yōu)勢，痰陽性患者組的α 多樣性往往低于痰陰性組， 兩組之間的β 多樣性存在顯著差異； 痰陽性組呼吸道微生物以結核分枝桿菌為主，而痰陰性組富含鏈球菌、普雷沃桿菌及奈瑟菌等，更加接近正常呼吸道微生物群，通過網(wǎng)絡分析表明， 結核分枝桿菌對微生物群落結構有很大的影響， 結核分枝桿菌可能對特定的分類群存在競爭。該實驗同樣利用16S rDNA 測序?qū)吮具M行研究與前期利用16S 測序?qū)嶒灥贸鲆恢陆Y論，同時該實驗表明16S rDNA 測序方法低估了結核分枝桿菌， 并不是研究結核相關微生物組的最佳方式。

對肺部微生物群的進一步認識可能在今后肺結核的預防、診斷及治療方面提供更好的策略。目前對于患者肺部微生物組的特征與肺結核的關系在很大程度上仍不明確。

4 益生菌在治療呼吸系統(tǒng)疾病中的應用前景

益生菌已經(jīng)成為未來治療呼吸系統(tǒng)疾病的研究熱點，益生菌可解釋為給予足夠的量時，會給宿主帶來健康益處的活的非致病微生物［61］。 益生菌可能成為抗生素的替代療法或聯(lián)合療法， 從而減少因過度使用或濫用抗生素治療而產(chǎn)生的耐藥性及微生態(tài)失衡。已有部分研究表明，口服益生菌將通過影響胃腸道菌群從而改變呼吸道菌群的組成［62］。胃腸道與呼吸道菌群如何相互影響，現(xiàn)代醫(yī)學提出了肺腸軸的理論， 該理論是利用免疫系統(tǒng)和定植在肺和腸道的微生物群作為連接樞紐，形成連接肺部和腸道的雙向軸［63］，這一理論對我國傳統(tǒng)醫(yī)學“肺與大腸相表里”做出了科學的解釋。也有學者對益生菌鼻腔給藥對呼吸道微生態(tài)的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)鼻腔給藥與口服相比，對于維持呼吸道微生態(tài)的平衡具有更高的療效， 可以降低COPD 患者的免疫反應， 從而達到緩解病情的目的［64］。 但是，一項針對益生菌治療COPD 療效的Meta 分析表明， 雖然益生菌已被廣泛應用并且具有一定的效果， 但是治療COPD 的臨床療效和安全性尚不清楚［65］，因此，還需要對益生菌的作用機制進行深入研究后決定是否可以應用于臨床治療。

5 小結

新一代測序技術的出現(xiàn)， 使人類對呼吸道微生態(tài)的認識更加深入， 對于呼吸系統(tǒng)疾病的呼吸道微生態(tài)的研究也更加詳細和全面。 鑒于上呼吸道微生物的影響， 痰標本所包含的微生態(tài)信息可能僅部分代表呼吸道微生態(tài)的情況。 呼吸道微生態(tài)受到多種因素的影響， 其與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的關系需要進一步明確。 呼吸道微生物組的研究仍然面臨許多挑戰(zhàn)，例如16S rDNA 測序技術中對可變亞區(qū)的選擇， 痰標本的獲取方法以及測序平臺的選擇，都會對最終獲得的結果造成影響。益生菌作為未來治療呼吸系統(tǒng)疾病的切入點，可以通過對機體炎癥反應及免疫反應的調(diào)控和干預實現(xiàn)治療的目的， 還可以通過直接參與平衡呼吸道微生態(tài)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療中。