基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討麝香保心丸治療動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制

王智聰，謝 彬，袁 星，徐希科，柳潤輝 （1.福建中醫(yī)藥大學(xué), 福建 福州 3501；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系,上海 00433）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）作為一種慢性進(jìn)行性疾病，能夠引發(fā)腦卒中等一系列心腦血管疾病，從而對(duì)人類生命健康產(chǎn)生極大的威脅。AS 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、血小板活化等有關(guān)[1]。西藥他汀類降脂藥被廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)脈粥樣硬化，但其仍存在一定的局限性[2]。中藥由于其具有多組分多靶點(diǎn)協(xié)同作用，在治療慢性復(fù)雜疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)因而受到更加廣泛的應(yīng)用[3]。

麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill, SBP）源于宋朝《太平惠民合劑局方》中的蘇合香丸[4]，收錄于2020 年版《中國藥典》，是國家中藥保密品種，上海和黃藥業(yè)公司的獨(dú)家生產(chǎn)品種。麝香保心丸由冰片、蟾酥、人工牛黃、人參提取物、肉桂、人工麝香和蘇合香組成，具有芳香溫通，益氣強(qiáng)心之功效。主要用于氣滯血瘀所致的胸痹和心肌缺血所致的心絞痛、心肌梗死[5]。麝香保心丸臨床上不僅作為心絞痛急性發(fā)作的治療藥物，還可以用于冠心病的長期防治[6]。臨床研究證實(shí)，長期（3 個(gè)月以上）服用麝香保心丸可減輕并延緩心肌缺血的發(fā)生發(fā)展，減少心血管危險(xiǎn)事件發(fā)生，并通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞 、減少脂質(zhì)浸潤和抑制炎癥等，阻遏AS 的發(fā)展實(shí)現(xiàn)[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，麝香保心丸具有減輕新西蘭大耳兔和apoE-/-小鼠AS 的作用[8-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是對(duì)復(fù)方中藥進(jìn)行研究的有效手段，能夠發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)、篩選生物活性成分、評(píng)價(jià)藥物毒性、研究作用機(jī)制和提高質(zhì)量控制[10]等。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段研究麝香保心丸治療AS 的作用機(jī)制，為麝香保心丸得到臨床長期應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 麝香保心丸靶點(diǎn)數(shù)據(jù)的收集和篩選

從TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）[11]、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）[12]和BATMAN（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）[13]等數(shù)據(jù)庫中獲取冰片、蟾酥、人工牛黃、人參提取物、肉桂、人工麝香、蘇合香等七味藥材所含化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。吸收、分布、代謝、排泄（ADME）指標(biāo)是篩選活性化合物的重要指標(biāo)，將全方所含化合物在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ADME 篩選，將OB≥20%且DL≥0.1 的化合物視為有效活性成分[14]，對(duì)不符合ADME 篩選的化合物進(jìn)行檢視，將已被證明為生物活性成分的化合物進(jìn)行回收，去除重復(fù)項(xiàng)，即得麝香保心丸全方有效成分及其潛在靶點(diǎn)。為了提高獲取數(shù)據(jù)的可信度，將所獲得的靶點(diǎn)信息進(jìn)行進(jìn)一步篩選，剔除BATMAN 數(shù)據(jù)庫中score 低于48 的靶點(diǎn)和TCMID 中score 低于400 的靶點(diǎn)，并去除僅有一個(gè)成分作用的靶點(diǎn)，得到全方靶點(diǎn)信息。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)的收集及篩選

從GeneCards（https://www.genecards.org/）[15]、OMIM（https://omim.org/）[16]、TCMSP（https://tcm spw.com/tcmsp.php）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）和 DisGeNet（https://www.disgenet.org/sear ch）[17]等數(shù)據(jù)庫中獲取動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)。剔除DisGeNet 中靶點(diǎn)分值低于0.02 的靶點(diǎn)和Gene Cards 中分值低于1 的靶點(diǎn)，合并各數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)，得到AS 相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白。

1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲取的麝香保心丸潛在靶點(diǎn)和AS 相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因ID。取兩者交集，得到麝香保心丸治療AS 相關(guān)靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的化合物，將獲取的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件中進(jìn)行進(jìn)一步分析，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以便于分析網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

通過STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)麝香保心丸治療AS的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入CytoScape3.8.2 軟件進(jìn)一步進(jìn)行分析，探究麝香保心丸治療AS 靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.5 生物功能注釋（GO）基因分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

使用Metascape（http://metascape.org）[18]數(shù)據(jù)庫對(duì)獲取的麝香保心丸抗AS 靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析，設(shè)定P＜0.01，取生物學(xué)過程（GOBP）、分子功能（GOMF）和細(xì)胞成分（GOCC）條目的前10 項(xiàng)，取KEGG 富集通路的前20 項(xiàng)，分析麝香保心丸治療AS 的主要相關(guān)通路及其功能。

2 結(jié)果

2.1 麝香保心丸主要活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

各個(gè)數(shù)據(jù)庫中共檢索到麝香保心丸中474 個(gè)化合物，對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)共有6 158 個(gè)。經(jīng)篩選后共得到麝香保心丸中化合物124 個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)為452 個(gè)。

2.2 麝香保心丸治療 AS 靶點(diǎn)的獲取

結(jié)合GeneCards、OMIM、TCMSP、DrugBank和DisGeNet 等數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過篩選，得到AS 相關(guān)靶點(diǎn)1 786 個(gè)。

2.3 化合物-靶點(diǎn)和PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

取麝香保心丸潛在靶點(diǎn)與AS 相關(guān)靶點(diǎn)繪制維恩圖（圖1），取二者交集，即得麝香保心丸治療AS 的175 個(gè)靶點(diǎn)，相關(guān)成分114 個(gè)。采用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)獲取的175 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到一個(gè)具有175 個(gè)點(diǎn)和2 303 個(gè)邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），通過對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，根據(jù)各靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度值判斷該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。在麝香保心丸治療AS 的過程中，ALB、INS、ACTB、AKT1、IL-6、TNF、IL-1B、PPARG、MAPK3、CREB1 等靶點(diǎn)的度值排在前10 位，表明這些靶點(diǎn)作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)起到最主要的作用。

圖1 麝香保心丸與動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)維恩圖

圖2 麝香保心丸治療動(dòng)脈粥樣硬化蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)

用CytoScape3.8.2 軟件構(gòu)建麝香保心丸治療AS 的化合物及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖3），得到具有289 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 166 條邊的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)，圖中化合物節(jié)點(diǎn)為紅色，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)為綠色。依據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)中各靶點(diǎn)度值對(duì)各化合物進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)化合物分值為其潛在作用靶點(diǎn)的度值之和，以分值高低為依據(jù)評(píng)判麝香保心丸治療AS 過程中的貢獻(xiàn)度，篩選出關(guān)鍵的20 個(gè)化合物（表1）。鵝去氧膽酸、人參皂苷Rb1、肉桂醛、膽酸、熊去氧膽酸等化合物作為關(guān)鍵化合物，分值為1 486、925、827、809 和805，分別作用63、17、42、49 和31 個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了中藥的多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用特點(diǎn)。

表1 麝香保心丸治療AS 過程中的關(guān)鍵化合物

圖3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 麝香保心丸治療AS 相關(guān)靶點(diǎn)的GO 富集分析和KEGG 富集分析

對(duì)GO 富集條目進(jìn)行分析（圖4），麝香保心丸調(diào)控的靶點(diǎn)在質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、細(xì)胞頂端部分等區(qū)域富集，影響核受體活性、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等分子功能，調(diào)節(jié)血液循環(huán)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等生物過程。KEGG 通路富集顯示（圖5），麝香保心丸主要調(diào)節(jié)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣離子信號(hào)通路、膽汁分泌等通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)AS 的治療效果。

圖4 GO 富集分析

圖5 KEGG 通路富集

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討麝香保心丸治療AS 相關(guān)化合物及其潛在靶點(diǎn)和通路。本研究發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸、人參皂苷Rb1、肉桂醛、膽酸、熊去氧膽酸可能在治療AS 時(shí)起到關(guān)鍵的作用。鵝去氧膽酸能夠降低機(jī)體炎癥反應(yīng)、提高機(jī)體的抗氧化能力和緩解細(xì)胞自噬[19]。熊去氧膽酸能夠促進(jìn)AS 模型ApoE(-/-)小鼠的膽固醇流出，降低炎癥反應(yīng)水平，減少AS 斑塊面積[20]。人參皂苷Rb1 能夠減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)自噬達(dá)到抑制ApoE(-/-)小鼠的早期AS 的發(fā)展[21]。肉桂醛[22]能夠調(diào)節(jié)IκB/NF-κB 通路從而抑制炎癥和氧化達(dá)到對(duì)AS 的治療效果。同時(shí)，這些關(guān)鍵成分也是麝香保心丸的入血成分，從側(cè)面驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析麝香保心丸治療AS 機(jī)制的可靠性[23]。

對(duì)麝香保心丸治療AS 的261 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到最主要的10 個(gè)靶點(diǎn)。有研究證實(shí)，ALB與AS 的嚴(yán)重程度具有顯著的相關(guān)性[24]。AKT1 參與代謝、細(xì)胞生長與存活、血管新生等多個(gè)過程進(jìn)而防治AS[25]。INS 是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵蛋白，胰島素抵抗是導(dǎo)致AS 的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素之一[26]。TNF 能夠調(diào)控細(xì)胞生長與凋亡[27]，且TNF 能與IL-6 和IL-1B 協(xié)同作用誘導(dǎo)VEGF 的生成，促進(jìn)血管新生[28]。PPARG 是降血脂藥的關(guān)鍵受體之一，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抑制炎癥[29]，對(duì)AS 的防治起到重要的作用。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)從各方面對(duì)AS 進(jìn)行治療，且相互之間存在協(xié)調(diào)作用，達(dá)到了更好的治療效果。

麝香保心丸治療AS 的靶點(diǎn)主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，對(duì)炎癥、免疫和氧化應(yīng)激等過程進(jìn)行調(diào)控，最終達(dá)到對(duì)AS 的治療作用。血管內(nèi)皮剪切應(yīng)力是心血管系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，低血管內(nèi)皮剪切應(yīng)力會(huì)誘發(fā)炎癥并且使內(nèi)皮細(xì)胞更容易被低密度脂蛋白和高血糖等危險(xiǎn)因素影響，促進(jìn)AS 的發(fā)展[30]。鈣離子作為第二信使在體內(nèi)發(fā)揮重要作用，能夠介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)生理功能，且鈣離子能夠促進(jìn)AS 斑塊的形成，研究證實(shí)AS 斑塊中的鈣離子濃度顯著增加[31]。膽汁酸代謝是調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇水平的關(guān)鍵途徑，且膽固醇還能通過與核受體協(xié)同作用進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，在AS 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[32]。對(duì)這些通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)麝香保心丸可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，調(diào)控炎癥、免疫、脂質(zhì)代謝，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用達(dá)到對(duì)AS 的治療效果。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法全方面、多角度對(duì)麝香保心丸治療動(dòng)脈粥樣硬化整體協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了治療過程中可能發(fā)揮主要作用的化合物、靶點(diǎn)和通路。本研究為麝香保心丸抗AS 的機(jī)制研究提供了思路，為臨床長期應(yīng)用提供理論依據(jù)。