4 種黃山菊花品種的抗氧化和抗炎活性研究

汪 麟，方 煜，余文武，洪 澤 （.黃山市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院, 安徽 黃山 45000；.黃山市光合生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司, 安徽 黃山 45）

菊花為菊科植物菊花的干燥頭狀花序，是一種常見的藥食兩用的花卉，具有清熱、明目、疏風(fēng)、解毒之功效[1-2]。根據(jù)經(jīng)典的記載，中國(guó)栽培菊花歷史已有3 000 多年。漢朝《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“菊花久服能輕身延年”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，菊花具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎以及保肝等作用[3-12]，因此，常作為保健飲品服用。安徽黃山是菊花的重要產(chǎn)地，擁有黃山金絲皇菊、黃山皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊等多個(gè)品種，其中皇菊的黃酮含量極高，富含多種氨基酸、維生素和微量硒元素，具有重要的藥用價(jià)值；而道地黃山貢菊更是菊花中的上等品，“白邊黃芯綠屁股”，處于四大藥菊之首。本研究主要對(duì)以上四種菊化品種進(jìn)行研究，對(duì)比其抗氧化及抗炎活性，為菊花抗氧化和抗炎品種的開發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與試劑

4 種菊花（黃山金絲皇菊、黃山皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊）來源于黃山市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS 法）、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP 法）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼試劑盒（DPPH 法）購(gòu)自Solarbio；雙報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega；LPS 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；SD 大鼠，雄性，體重180～220g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菊花提取工藝

4 種不同菊花經(jīng)粉碎機(jī)粉碎并過60 目篩，各取100 g，加入1 000 ml 去離子水浸泡12 h，然后加熱回流提取2 h，過濾去除濾渣，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60 ℃）蒸發(fā)去除溶劑，然后經(jīng)真空干燥徹底去除水分[13]。由于4 種菊花水提物得率基本一致（約17%），因此后續(xù)用相同質(zhì)量的水提物表征同等質(zhì)量的菊花。

2.2 ABTS 法檢測(cè)抗氧化能力

將等體積的ABTS 溶液和氧化劑溶液混合配置成ABTS 工作母液，室溫避光存放24 h。使用前，把ABTS 工作液用PBS 稀釋30～50 倍，要求ABTS 工作液的吸光度減去相應(yīng)的PBS 空白對(duì)照后，A734 為0.7±0.05，對(duì)應(yīng)的A405 在1.4 左右。稱取菊花粗提物粉末100 mg，用適量蒸餾水充分溶解。同時(shí)，用蒸餾水將10 mmol/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol/L。于96 孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入200 μl ABTS 工作液，空白對(duì)照孔中加入10 μl 蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔中加入10 μl 各濃度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔中加入10 μl 樣品溶液，輕輕混勻。室溫孵育2～6 min 后測(cè)定A734。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力[14]。

2.3 FRAP 法檢測(cè)總抗氧化能力

將TPTZ 稀釋液與TPTZ 溶液充分混勻再加入檢測(cè)緩沖液，從而配制成FRAP 工作液。稱取菊花粗提物粉末100 mg，用適量蒸餾水充分溶解。稱取27.8 mg 本試劑盒提供的 FeSO4·7H2O，溶解并定容到1 ml，此時(shí)濃度即為100 mmol/L。取適量100 mmol/L FeSO4 溶液用蒸餾水稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol/L。于96 孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μl FRAP 工作液，空白對(duì)照孔中加入5 μl 蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔中加入5 μl 各濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔中加入5 μl 樣品溶液，輕輕混勻。室溫孵育2～6 min 后測(cè)定A593。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力[14]。

2.4 DPPH 法檢測(cè)總抗氧化能力

稱取菊花粗提物粉末100 mg，用適量蒸餾水充分溶解。同時(shí)，用蒸餾水將10 mmol/L Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol/L。于96 孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入190 μl DPPH 工作液，空白對(duì)照孔中加入10 μl 蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔中加入10 μl 各濃度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔中加入10 μl 樣品溶液，混勻后室溫避光靜置30 min，測(cè)定A515。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力[14]。

2.5 雙報(bào)告基因法測(cè)定菊花提取物的抗炎活性

Raw264.7 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96 孔板，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置空白組、LPS 刺激組和不同藥物濃度處理組，每組分別設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞過夜貼壁，利用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc 和pRL-SV40，轉(zhuǎn)染6 h 后換液。轉(zhuǎn)染24 h 后加藥，藥物孵育2 h 后加入LPS（終濃度1 μg/ml）刺激6 h，雙報(bào)告基因法檢測(cè)NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性。

2.6 菊花提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的治療作用

取SD 大鼠48 只，隨機(jī)分為6 組，分別為空白組、模型組、菊花水提物給藥組（2 g/ kg，相當(dāng)于菊花11.76 g/kg）。各組大鼠連續(xù)灌胃給藥3 d，模型組給予相同體積的生理鹽水，第4 天于每只大鼠右后足墊皮下注射1.0%角叉菜膠100 μl，致炎后灌胃給予相應(yīng)藥物，分別在致炎前和致炎后1、2、4 h，測(cè)量大鼠致炎側(cè)足容積，計(jì)算足趾腫脹率和腫脹抑制率[15-16]。按下式計(jì)算小鼠足趾腫脹率和抑制率：腫脹率=（致炎后足趾體積-致炎前足趾體積）/致炎前足趾體積×100%, 抑制率= (模型組足趾腫脹率-給藥組足趾腫脹率)／模型組足趾腫脹率×100%。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 線性關(guān)系

ABTS、FRAP 和DPPH 線性方程以及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 ABTS、FRAP、DPPH 的線性方程及相關(guān)系數(shù)

從表1 可以看出，ABTS、FRAP 以及DPPH 測(cè)定方法具有很好的線性。

4.2 4 種菊花水提物抗氧化能力

ABTS 法檢測(cè)菊花水提物總抗氧化能力，結(jié)果顯示，4 種菊花的抗氧化能力存在明顯差異，其中，黃山金絲皇菊抗氧化能力最強(qiáng)，為（0.481±0.052）mmol/g（總抗氧化能力用TEAC 標(biāo)準(zhǔn)溶液表示），其次是黃山皇菊，為（0.402±0.043）mmol/g，然后依次是 黃 山 貢 菊（0.369±0.031）mmol/g 和 黃 山 黃 菊（0.287±0.014）mmol/g。FRAP 和DPPH 檢測(cè)以上四種菊花水提物抗氧化能力，結(jié)果與ABTS 法類似，黃山金絲皇菊抗氧化能力最強(qiáng)，其次依次是黃山皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊。綜上，可以得出結(jié)論：黃山金絲皇菊水提物抗氧化能力最強(qiáng)，其次是黃山皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊（表2）。

表2 4 種菊花抗氧化能力

4.3 4 種菊花水提物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性的影響

利用雙報(bào)告基因的方法檢測(cè)4 種菊花水提物對(duì)Raw264.7 細(xì)胞 NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果顯示4 種菊花水提物均能夠一定程度的抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性。相同作用濃度下，黃山皇菊NF-κB 抑制活性最強(qiáng)，其次依次是黃山金絲皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊。結(jié)果表明黃山皇菊抗炎作用最強(qiáng)，其次是黃山金絲皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊（圖1）。

圖1 4 種菊花水提物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性的影響

4.4 4 種菊花水提物對(duì)角叉菜膠致大鼠急性炎癥的影響

為了進(jìn)一步確認(rèn)4 種菊花提取物的抗炎活性，我們構(gòu)建了角叉菜膠致大鼠足腫脹模型。大鼠足趾腫脹率和腫脹抑制率如表3 所示，1 h 時(shí)間點(diǎn)，給予菊花水提物處理的各組大鼠足趾腫脹均低于模型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2 h 時(shí)間點(diǎn)，黃山皇菊和黃山金絲皇菊對(duì)足趾腫脹仍然具有抑制作用，而黃山貢菊和黃山黃菊抑制作用消失;組間比較，黃山皇菊足趾腫脹抑制作用優(yōu)于黃山貢菊和黃山黃菊（P＜0.05）。4 h 時(shí)間點(diǎn)，各組對(duì)足趾腫脹的抑制作用消失。綜上結(jié)果表明，黃山皇菊的抗炎活性最好，其次是黃山金絲皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊，該結(jié)論與NF-κB 報(bào)告基因結(jié)果一致。

表3 角叉菜膠致大鼠急性炎癥模型結(jié)果(±s，n=8)

表3 角叉菜膠致大鼠急性炎癥模型結(jié)果(±s，n=8)

*P＜0.05，與黃山貢菊比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與模型組比較；ΔΔP＜0.01，與黃山黃菊比較。

組別1 h 2 h 4 h腫脹率(%)抑制率(%)模型組 41.6±抑制率(%)腫脹率(%)抑制率(%)腫脹率(%)4.5 - 52.5±10.7 - 45.1±8.2 -黃山金絲皇菊31.5±5.9# 24.3 42.3±7.1# 19.5 44.9±8.8 0.5黃山皇菊 28.9±5.9## 30.6 38.9±7.8#,*,ΔΔ 26.0 46.4±10.0 -2.8黃山貢菊 31.8±6.3# 23.7 50.0±11.7 4.8 46.4±8.3 -2.8黃山黃菊 33.3±6.2# 20.1 51.0±7.3 2.9 44.9±8.8 0.6

5 結(jié)論

本研究采用ABTS、FRAP 和DPPH 這3 種方法測(cè)定了4 種黃山菊花水提物的抗氧化活性，并通過報(bào)告基因法和大鼠足腫脹模型評(píng)估了其抗炎活性。結(jié)果表明，4 種菊花表現(xiàn)出不同的抗氧化活性和抗炎活性，其中黃山金絲皇菊的抗氧化能力最強(qiáng)，其次是黃山皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊；而黃山皇菊的抗炎活性最強(qiáng)，其次是黃山金絲皇菊、黃山貢菊和黃山黃菊。菊花中黃酮類化合物具有清除自由基和超氧陰離子的能力，其抗氧化能力與黃酮類化合物含量有關(guān)；而菊花中的抗炎成分相對(duì)復(fù)雜，包含多糖、黃酮類化合物（如木犀草素、槲皮素及黃芩苷等）、有機(jī)酸（如綠原酸）和揮發(fā)油等，4 種不同菊花在抗炎及抗氧化方面的活性差異可能與上述成分的差異有關(guān)[2,17-18]。盡管不同菊花品種在抗氧化和抗炎活性方面存在差異，但是均表現(xiàn)出良好的藥用及食用價(jià)值，人們?cè)谌粘Ｉ钪锌梢愿鶕?jù)使用目的的不同進(jìn)行選擇，如考慮通過飲用菊花茶起到抗氧化目的，可以優(yōu)先選用金絲皇菊，而如果考慮菊花抗炎作用，則可以考慮黃山皇菊。綜之，4 種黃山道地菊花提取物均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性及抗炎活性，常飲之有保健功效。