外泌體用于疾病診療和藥物遞送的研究進(jìn)展

王宏播，卞康晴，郭靈怡，代 宇，俞 媛 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)教研室, 上海 200433）

外泌體（exosome）是細(xì)胞產(chǎn)生的胞外囊泡的一種，在20 世紀(jì)80 年代末首次被描述[1-2]。外泌體作為一種細(xì)胞間近距離通訊的特殊介質(zhì)，在包括免疫反應(yīng)、抗原遞呈和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]等各種生理過程中發(fā)揮著重要作用。幾乎所有真核細(xì)胞都可以分泌外泌體，包括脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，外泌體幾乎存在于所有體液如腦脊液、尿液、精子、唾液、血液、玻璃體和乳汁等[4]，含有豐富的核酸、蛋白、脂質(zhì)和代謝物等。外泌體所攜帶的物質(zhì)由于源細(xì)胞的類型及其所處狀態(tài)（例如轉(zhuǎn)化、分化、刺激和壓力）不同而存在很大差異，由其大小、內(nèi)容物含量、對受體細(xì)胞的功能影響以及細(xì)胞來源來概念化，因此是一個高度異質(zhì)性的群體，具有獨(dú)特的誘導(dǎo)生物學(xué)反應(yīng)的能力，也為一些疾病如代謝性疾病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等提供診斷和預(yù)后信息[5]。此外，作為一種納米粒徑的內(nèi)源性囊泡，高生物相容性、天然的歸巢性能、以及進(jìn)行功能化修飾后實(shí)現(xiàn)更特異性的組織器官和病灶部位的富集，都使得外泌體作為一種新型藥物遞送載體具有很好的研究價值。本文就外泌體的提取分離方法，在疾病中的診療作用以及工程化修飾后用于藥物遞送做一綜述。

1 外泌體的生物發(fā)生機(jī)制及分離純化

外泌體的發(fā)生機(jī)制主要涉及質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷。質(zhì)膜的第一次內(nèi)陷形成早期分選內(nèi)含體（ESEs），此時ESEs 膜內(nèi)表面上附著細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞外環(huán)境相關(guān)的可溶性蛋白，有時新形成的ESEs 可直接與預(yù)先存在的ESEs 合并。ESEs 在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的幫助下形成晚期分選內(nèi)含體（LSEs）并再次內(nèi)陷形成多泡體（MVBs），MVBs 包含數(shù)個腔內(nèi)小泡（ILVs）。MVBs 可以與溶酶體或自噬體融合以被降解，也可以與質(zhì)膜融合以釋放包含的ILVs，ILVs 釋放后即形成直徑約40～160 nm的外泌體[6-7]。

目前常用的外泌體分離方法有超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、色譜法、免疫親和法、聚合物沉淀法等，分別采用不同的分離機(jī)制，所得到的外泌體具有不同的得率和純度，其主要原理和優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 外泌體的分離方法及特點(diǎn)

2 外泌體在疾病中的診療應(yīng)用

外泌體與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，遞送至受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、代謝物和核酸有效地改變了它們的生物反應(yīng)，這種外泌體介導(dǎo)的反應(yīng)可以促進(jìn)或抑制疾病的進(jìn)程。作為一種通訊介質(zhì)，外泌體具有調(diào)節(jié)復(fù)雜細(xì)胞內(nèi)通路的特性。作為一種治療工具，外泌體避免了如不受控制的細(xì)胞分裂、致瘤性以及血管栓塞等與細(xì)胞治療相關(guān)的安全問題[16]。除了治療因素，外泌體具有輔助疾病診斷的特性，它們存在于幾乎所有生物體液中，通過對生物體液取樣很容易獲得并檢測其內(nèi)容物組成，從而對疾病進(jìn)展做出判斷以及確定治療方法。

2.1 肝纖維化和肝損傷

一些外泌體中的核酸物質(zhì)可以作為疾病診斷的特異性分子。Niu 等[17]發(fā)現(xiàn)血清外泌體中的miR-155 與肝硬化的進(jìn)展和肝硬化的臨床預(yù)后指標(biāo)密切相關(guān)，表明富含miR-155 的外泌體可作為肝纖維化診斷和進(jìn)展的非侵入性生物標(biāo)志物。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，脂多糖處理的巨噬細(xì)胞外泌體高表達(dá)miR-500 能通過抑制MFN2促進(jìn)肝星形細(xì)胞活化和肝纖維化。因此，血清外泌體的miR-500 也可作為肝纖維化的生物標(biāo)志物[18]。Rong 等[19]的研究表明，在SD 大鼠肝纖維化模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（BMSC-Exo）通過抑制 WNT/β-catenin 通路降低了CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的能力，能夠有效減輕肝纖維化，包括減少膠原蛋白積聚，增強(qiáng)肝功能，抑制炎癥和增加肝細(xì)胞再生。類似地，Damania 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞的2D/3D 培養(yǎng)條件的體外肝損傷模型以及由CCl4引起的大鼠急性肝損傷模型中，大鼠BMSCExo 具有抗凋亡、抗氧化和促細(xì)胞存活作用。能明顯減少缺血再灌注損傷，可用于臨床肝移植或治療急性肝功能衰竭。

2.2 骨關(guān)節(jié)疾病

源自骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的外泌體可以通過miR-449a 刺激炎癥小體活化并增加巨噬細(xì)胞中成熟的IL-1β 產(chǎn)生，可能加重滑膜炎并加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[21]。BMSC-Exo 同時具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗炎作用，Casado 等[22]在抗原觸發(fā)的豬滑膜炎模型中發(fā)現(xiàn)，BMSC-Exo 處理后，模型動物關(guān)節(jié)中的白細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化，但淋巴細(xì)胞顯著減少，并伴隨著滑液中的炎性細(xì)胞因子顯著下降，對治療滑膜炎具有積極意義。Qin 等[23]測試了BMSC-Exo在體外調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性和體內(nèi)骨再生中的作用，與miR-27a 和miR-206 處理相比，用miR-196a 處理的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出最好的成骨活性。miR-196a是典型的成骨相關(guān)miRNA，在BMSC-Exo 中高度富集，證明了BMSC-Exo 在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和成骨基因表達(dá)中的重要作用。Chen 等[24]發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的外泌體可以在皮下環(huán)境中誘導(dǎo)軟骨祖細(xì)胞構(gòu)建體的有效異位軟骨形成，這可能代表了一種用于軟骨再生的無細(xì)胞治療方法。

2.3 心血管疾病

動脈粥樣硬化是最常見的心血管疾病之一。Hergenreider[25]發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在剪切力刺激下分泌的外泌體富含miR-143/145，其控制共培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞中靶基因KLF2 的表達(dá)，從而減少ApoE（-/-）小鼠主動脈粥樣硬化的形成。冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲后，易產(chǎn)生急性冠狀動脈綜合征（ACS）。外泌體中的豐富miRNA 可以成為診斷和治療ACS 的重要工具[26]。有研究發(fā)現(xiàn)ACS患者血清中的外泌體miR-208a 水平顯著高于健康個體[27]。心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織供血中斷一段時間后恢復(fù)，但心肌組織損傷加重的現(xiàn)象。Lai 等[28]在小鼠急性心肌缺血再灌注損傷的心臟模型中發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞通過減少心肌梗死面積產(chǎn)生心臟保護(hù)作用，而其保護(hù)作用主要通過旁分泌中的外泌體起效。Zou 等[29]以H9C2 細(xì)胞系建立大鼠心肌缺血再灌注模型用于研究心肌發(fā)病過程，BMSC-Exo 處理后的缺血再灌注過程中對細(xì)胞增殖、遷移以及心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用，表現(xiàn)為Apaf1（凋亡蛋白酶激活因子1）表達(dá)被顯著抑制，ATG13（自噬相關(guān)蛋白13）表達(dá)在體內(nèi)顯著增加，證明BMSC-Exo 還可以通過調(diào)節(jié)自噬機(jī)制抑制與心肌梗死相關(guān)的心肌損傷。心力衰竭由多種因素帶來的心肌收縮功能障礙引起，有研究者在小鼠壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大模型中發(fā)現(xiàn)小鼠BMSC-Exo通過抑制心肌病理性肥大、抑制心肌細(xì)胞凋亡和減少心臟纖維化，在抑制心肌重構(gòu)中產(chǎn)生重要作用，為心力衰竭等疾病提供了全新有效的治療策略[30]。

2.4 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

基于親代細(xì)胞，外泌體可用作神經(jīng)退行性疾病、腦創(chuàng)傷、卒中等中樞疾病診斷預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，或產(chǎn)生治療作用。如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體可以通過傳遞miR-21-3p 抑制ATG12信號傳導(dǎo)來減弱缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[31]。在Wistar 大鼠中風(fēng)模型中，BMSC-Exo 處理的動物組皮層和紋狀體的缺血邊界區(qū)軸突密度和突觸素陽性區(qū)域增加，增強(qiáng)了神經(jīng)突重塑、神經(jīng)發(fā)生和血管生成，從而實(shí)現(xiàn)中風(fēng)后腦功能恢復(fù)[32]。Zhang 等[33]在Wistar 大鼠受控皮質(zhì)沖擊誘發(fā)的創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）模型中使用人BMSC-Exo 治療TBI，發(fā)現(xiàn)顯著增加了病變邊界區(qū)和齒狀回新生內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，增加了齒狀回新生成熟神經(jīng)元的數(shù)量，并減少了神經(jīng)炎癥，同樣證明了BMSC-Exo 對腦功能恢復(fù)和神經(jīng)血管重塑的促進(jìn)作用。在神經(jīng)退行性疾病中，BMSC-Exo 可以再生神經(jīng)并改善神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)知功能和記憶障礙[34]。Cui 等[35]發(fā)現(xiàn)經(jīng)缺氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體抑制了β 淀粉樣蛋白的積累，并增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因APP/PS1 阿爾茨海默病模型小鼠大腦中的突觸蛋白表達(dá)，此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少、炎癥因子如抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10 增加和促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-1β 的減少得到驗(yàn)證。作為診斷標(biāo)記物，腦脊液外泌體中的miRNA 包括let-7f-5p、miR-27a-3p、miR-125a-5p、miR-151a-3p 和miR-423-5p 可 作 為生物標(biāo)志物用于帕金森病的早期診斷，從分子水平發(fā)揮疾病診斷的精確作用。Kojima 等[36]發(fā)現(xiàn)負(fù)載過氧化氫酶mRNA 的外泌體能夠減輕6-羥基多巴胺（6-OHDA）或LPS 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中的神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥。加載過氧化氫酶的外泌體在體外PC12 神經(jīng)元細(xì)胞和PD 的體內(nèi)6-OHDA 模型中引發(fā)神經(jīng)保護(hù)作用[37]。

2.5 腫瘤

外泌體攜帶的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物通過自分泌和旁分泌影響受體細(xì)胞，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、免疫、耐藥等方面起到重要作用。多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體含有較高的miRNA-15a 及較多的細(xì)胞因子和黏附分子，能夠促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖[38]。乳腺癌細(xì)胞外泌體含有的miR-105 降低了ZO1 在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)滲透[39]。腫瘤衍生的外泌體或胞外囊泡可激活免疫反應(yīng)，外泌體將腫瘤抗原熱休克蛋白HSP70-80 和MHC-I 分子轉(zhuǎn)移到DC 細(xì)胞，從而對小鼠腫瘤產(chǎn)生有效的CD8+T 細(xì)胞依賴性抗腫瘤作用[40-41]。巨噬細(xì)胞外泌體通過轉(zhuǎn)運(yùn)miR-365 激活了胰腺癌細(xì)胞的胞苷脫氨酶，降低其對吉西他濱的敏感性，顯示出外泌體在腫瘤耐藥性中的作用[42]。外泌體還可以作為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。例如對循環(huán)外泌體DNA 檢測能夠發(fā)現(xiàn)KRASG12D 和TP53R273H 突變，它們是胰腺癌的潛在生物標(biāo)志物[43]。血漿外泌體的PD-L1 水平與頭頸癌的疾病進(jìn)展有關(guān)[44-45]，還能預(yù)測黑色素瘤患者對PD1 抗體治療的反應(yīng)[46]。

3 外泌體作為藥物遞送載體

外泌體是一種小粒徑的內(nèi)源性微粒，具有靶向組織特異性、體循環(huán)穩(wěn)定性、良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。通過不同的載藥方式，外泌體可以負(fù)載不同的藥物，通過與源細(xì)胞特殊的親和作用、歸巢效應(yīng)等自然趨向作用，將負(fù)載的藥物運(yùn)送到靶向組織[47]。而在外泌體中加載其他藥物，或者進(jìn)行工程化修飾，能賦予它們對特定組織、受體細(xì)胞的選擇性，改變體內(nèi)分布，實(shí)現(xiàn)更高效的藥物靶向遞送，從而提高治療效果。

3.1 直接將藥物載入外泌體

有多種物理方法可以將藥物加載到外泌體中，如共孵育法、電穿孔、機(jī)械擠壓、超聲、凍融等。其中共孵育法簡單快捷，但效率低且不適合親水性分子；電穿孔可以同時作用于親水和疏水物質(zhì)，但容易引起外泌體聚集并損害外泌體膜的完整性；機(jī)械擠壓和超聲載藥效率高，能同時改變外泌體尺寸，但也會引起聚集和膜損傷；凍融方法簡單快速，但效率低且對外泌體尺寸有很大影響。

小的親脂性分子可以通過與外泌體共孵育被動加載到外泌體中，比如多柔比星（Dox）和紫杉醇（PTX），它們在室溫下與外泌體共同孵育即可載入外泌體，其負(fù)載能力分別為PTX 7.2%，Dox 11.7%[48-49]。除此之外，利用物理的輔助手段，可以增加生物活性大分子藥物的載入。例如，Haney 等[37]用外泌體裝載過氧化氫酶治療帕金森病，外泌體保護(hù)了過氧化氫酶不被降解，并使其在病變部位持續(xù)釋放，從而用于治療神經(jīng)疾病。他們研究了包括機(jī)械擠壓、超聲、皂苷透化、凍融循環(huán)等機(jī)械處理方法對加載過氧化氫酶效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲和擠壓外泌體能最顯著提高其過氧化氫酶的加載效率并提高其釋放能力，而使用皂苷透化處理能提高其加載效率但降低其釋放能力。Alvarez-Erviti 等[50]將siRNA 通過電穿孔方法加載到外泌體中用于治療阿爾茨海默病，沉默β-淀粉樣蛋白形成相關(guān)的BACE1 基因，目標(biāo)蛋白敲除效率達(dá)到62%。而Kamerkar 等[51]則將沉默KrasG12D 的siRNA 加載到外泌體中，成功抑制了多種胰腺癌小鼠模型中的腫瘤生長，顯著提高了動物的生存率。Shtam 等[52-53]分別利用Lipofectamine 試劑轉(zhuǎn)染法和電穿孔法將siRNA 導(dǎo)入到HeLa 細(xì)胞外泌體中，而后外泌體可將siRNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)，這是一種類似于外源性納米微粒的核酸遞送方法，但轉(zhuǎn)染試劑存在一定毒性，且其載入效率不如電導(dǎo)入方法[54]。Sterzenbach 等[55]用WW 標(biāo)簽標(biāo)記目標(biāo)蛋白Cre 重組酶，能使其被含有L 結(jié)構(gòu)域的蛋白Ndfip1 識別并泛素化，從而將其加載到外泌體中，因此目標(biāo)蛋白的泛素化能提高外泌體的蛋白裝載。

3.2 通過源細(xì)胞將藥物載入外泌體

將藥物裝載于外泌體中最廣泛應(yīng)用的方法是以藥物孵育外泌體源細(xì)胞，使得分泌的外泌體攜帶部分藥物；或者轉(zhuǎn)染源細(xì)胞，源細(xì)胞可以過表達(dá)特定的產(chǎn)物并將其包裝到外泌體中或在外泌體膜上[13]。如利用DNA 載體表達(dá)能與外泌體蛋白融合的蛋白HPV-E7 和Nef，這些融合蛋白富含于外泌體中，從而提高了靶蛋白在外泌體中的特異性和負(fù)載效率[56]。通過使用miRNA 表達(dá)載體或pre-miRNA，將miRNA 轉(zhuǎn)染到源細(xì)胞中，然后導(dǎo)入外泌體，過表達(dá)miR-29 的HEK293T 細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體抑制了胃癌的血管生成[57]。L.H.等[58]分別用PTX、依托泊苷、卡鉑、伊立替康、表柔比星和米托蒽醌等孵育HepG2 細(xì)胞，隨后發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的外泌體與人胰腺細(xì)胞系CFPAC-1 共孵育，能產(chǎn)生顯著的抗增殖活性，外泌體通過源細(xì)胞的藥物攝取實(shí)現(xiàn)載藥。此外，刺激源細(xì)胞有時也能提高外泌體內(nèi)有效物質(zhì)的含量，Zhang 等[59]用三種刺激物刺激THP-1 單核細(xì)胞，導(dǎo)致其分泌的外泌體中miR-150 水平升高從而增強(qiáng)其效能。

4 外泌體的靶向性修飾

細(xì)胞來源、給藥途徑和劑量等許多因素都會影響外泌體在體內(nèi)的生物分布。天然的外泌體通常分布到小鼠的肝臟、脾臟、腸道和肺部，與外源性納米微粒一樣，易被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)捕獲從而清除[60]。與對照小鼠相比，在巨噬細(xì)胞耗竭的小鼠中，外泌體從循環(huán)中清除的速度要慢得多[61]。為了克服這些缺點(diǎn)，進(jìn)行工程化修飾的外泌體增加了其在被單核吞噬細(xì)胞清除之前到達(dá)靶細(xì)胞/組織的能力，從而提高藥物遞送效率，減少脫靶/副作用。在外泌體的天然趨向性基礎(chǔ)上，研究人員主要通過如共價修飾、基因修飾等方法實(shí)現(xiàn)增加外泌體的靶向遞送性能[62-63]。

4.1 外泌體表面的共價修飾

點(diǎn)擊化學(xué)利用炔烴和疊氮?dú)埢g的共價相互作用形成穩(wěn)定的三唑鍵，可用于在各種水性緩沖液（包括水、醇和二甲亞砜）中將靶向分子連接到外泌體表面[64-65]。聚乙二醇化是用支鏈PEG 修飾外泌體表面，是使用共價連接的化學(xué)偶聯(lián)方法最常見方法[66]。Kim 等[67]用氨基乙基茴香酰胺-PEG（AAPEG）修飾外泌體，AA-PEG 是σ 受體的靶向配體，外泌體通過AA-PEG 靶向至過度表達(dá)σ 受體的肺癌。Chen 等[68]證明通過點(diǎn)擊化學(xué)用神經(jīng)纖毛蛋白-1 靶向肽RGE 修飾的外泌體可促進(jìn)其在原位膠質(zhì)瘤小鼠模型中對血腦屏障的滲透和膠質(zhì)瘤靶向，腫瘤組織的藥物積累量增加了近1.5 倍，并且外泌體在腫瘤中的保留時間延長。類似地，c（RGDyK）是一種對整合素avb3 具有高親和力的肽，在缺血后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，Tian 等[69]通過點(diǎn)擊化學(xué)將其結(jié)合到MSC-Exo 表面，用于治療中風(fēng)，c（RGDyK）修飾的外泌體對小鼠缺血性腦損傷區(qū)域的趨向性比對照組高11 倍。而Smyth 等[70]發(fā)現(xiàn)Azide-Fluor545 熒光分子可以通過基于炔烴的交聯(lián)反應(yīng)附著在外泌體表面，而不會改變外泌體的大小和特性。共價鍵是一種非常穩(wěn)定的鍵，但該反應(yīng)不是位點(diǎn)特異性的，因而無法控制哪些氨基（例如，N-末端氨基、賴氨酸殘基的ε-氨基）或哪些蛋白質(zhì)被修飾，可能會屏蔽一些蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用從而改變外泌體的識別特性。

通過共價結(jié)合將siRNA 與脂肪酸、甾醇和維生素等脂質(zhì)結(jié)合物結(jié)合，可通過間接的疏水相互作用將靶分子插入外泌體膜[71]。Vandergriff 等[72]將心臟干細(xì)胞衍生的外泌體通過DOPE-NHS 與心臟歸巢肽CHP 鏈接，介導(dǎo)外泌體靶向至心臟。與DOPE 一樣，膽固醇因?yàn)榫哂惺杷砸部梢宰越M裝成外泌體膜。Pi 等[73]用RNA 適配子或葉酸綴合的膽固醇對外泌體進(jìn)行表面修飾，將siRNA 和miRNA遞送到相應(yīng)的腫瘤部位并增強(qiáng)了抗腫瘤功效。

4.2 基因修飾外泌體

除了以上直接修飾外泌體的方法外，還可以通過基因修飾產(chǎn)生外泌體的源細(xì)胞從而間接對外泌體進(jìn)行工程化修飾。與直接修飾外泌體相比，該方法在靶向物表達(dá)產(chǎn)量和穩(wěn)定性方面具有優(yōu)勢[74-75]。研究人員通過轉(zhuǎn)染在外泌體源細(xì)胞上表達(dá)與外泌體膜成分（如四跨膜蛋白、Lamp2b 和乳黏蛋白的C1C2 結(jié)構(gòu)域）融合的靶向部分（如肽、受體和抗體），從而產(chǎn)生具有相應(yīng)靶向物的外泌體[74-76]。如用狂犬病毒糖蛋白RVG 修飾Lamp2B 的N 端，RVG 與富含神經(jīng)元細(xì)胞的乙酰膽堿受體特異性結(jié)合，將融合了RVG 的Lamp2B 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，產(chǎn)生了在膜外表達(dá)RVG 蛋白的外泌體[50]。Kooijmans 等[77]將編碼抗表皮生長因子受體（EGFR）的基因轉(zhuǎn)染到Neuro2A 細(xì)胞內(nèi)，使該細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體表達(dá)EGFR，使其能與源自衰變加速因子（DAF）的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定信號肽融合，從而靶向腫瘤細(xì)胞。Shimbo 等[78]將合成的miR-143 轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所分泌的外泌體內(nèi)miR-143 增加，這種過表達(dá)miR-143 的外泌體遞送到人骨肉瘤細(xì)胞系143B 可以導(dǎo)致其遷移受到抑制。

5 外泌體-納米載體雜合

近年來，多種外泌體-納米粒雜合體的開發(fā)例如外泌體-脂質(zhì)體、外泌體-無機(jī)納米粒等，極大豐富了外泌體的可塑性，已被用于多種疾病的協(xié)同診斷和治療。

5.1 外泌體-脂質(zhì)體雜合

外泌體-脂質(zhì)體雜合可用于優(yōu)化外泌體表面的特性，增加其載藥性能和膠體穩(wěn)定性、提高粒子在血液中的穩(wěn)定性，通過脂質(zhì)體表面修飾增加靶細(xì)胞對外泌體的攝取。Tan 等[79]設(shè)計了外泌體-脂質(zhì)體雜化納米粒從而更有效地輸送CRISPR-Cas9 表達(dá)載體，這些雜化納米粒被內(nèi)吞后有效地抑制了MSCs 中mRunx2 基因和hCTNNB1 基因的表達(dá)。Sato 等[67,80]等將外泌體和脂質(zhì)體在液氮中反復(fù)多次凍融來產(chǎn)生外泌體-脂質(zhì)體雜合體，與從RAW264.7細(xì)胞或HeLa 細(xì)胞中分離的原始外泌體相比，外泌體-脂質(zhì)體雜合體增強(qiáng)了與HeLa 細(xì)胞的膜融合，證明了這些雜合外泌體提高了對受體細(xì)胞的靶向性。但凍融法也有缺點(diǎn)，它有可能改變外泌體上膜蛋白的完整性和方向性，從而削弱它們的生物功能[81]。外泌體-脂質(zhì)體雜合可以提高藥物的遞送效率，如Piffoux 等[82]使用靜電作用來誘導(dǎo)陽離子脂質(zhì)體與外泌體的融合，強(qiáng)陽離子電荷增強(qiáng)了外泌體與受體細(xì)胞的結(jié)合和細(xì)胞攝取，與游離藥物或載藥脂質(zhì)體前體相比，膜融合的雜合外泌體將化療藥物的細(xì)胞遞送效率提高了3～4 倍。此外，雜合體的脂質(zhì)電荷還會影響靶細(xì)胞的攝取，與陽離子脂質(zhì)體雜合的外泌體相比，中性或陰離子脂質(zhì)體雜合的外泌體更有可能被癌細(xì)胞系攝取[64-65]。

5.2 外泌體-無機(jī)納米粒雜合

金屬納米粒子、金屬氧化物納米粒子和量子點(diǎn)（QD）等無機(jī)納米粒子具有優(yōu)異的物理特性，如等離子體、磁性和熒光特性等，因此利用這些納米粒與外泌體雜合，可能會產(chǎn)生協(xié)同治療效果。Khongkow 等[83]用機(jī)械擠壓的方法制備的外泌體和金納米粒的雜合粒子，可以改善它們穿過血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)能力并特異性識別和靶向神經(jīng)元細(xì)胞。Wang 等[84]將裝載有阿霉素的外泌體與磁性納米粒Fe3O4雜合，使得雜合粒子可以在外部磁場誘導(dǎo)下靶向腫瘤部位從而產(chǎn)生更好的治療效果。Cheng 等[85]將腫瘤細(xì)胞外囊泡與金屬-有機(jī)框架材料（MOF）雜合，利用生物膜成分保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白酶消化和逃避免疫系統(tǒng)清除，并選擇性地靶向同型腫瘤部位，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取和內(nèi)化粒子后負(fù)載藥物的自主釋放。

6 小結(jié)與展望

外泌體是細(xì)胞釋放的一類天然納米級囊泡，可以被體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌，作為一種特殊的細(xì)胞間通訊載體，攜帶和傳遞重要的信號分子，在多種生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用。隨著以微流控芯片為代表的外泌體檢測手段的不斷更新，外泌體的研究為多種疾病的提前診斷和預(yù)后評估提供支持[86]。外泌體具有不均一性和異質(zhì)性的特點(diǎn)，使不同來源的外泌體具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，不僅涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、心血管疾病、免疫反應(yīng)、器官發(fā)育、組織動態(tài)平衡等，還涉及植物學(xué)和微生物學(xué)的研究內(nèi)容[74]。但是外泌體的分離純化過程依然存在一些問題，無論是離心法還是商業(yè)試劑盒都不能特異性地完全分離外泌體，從培養(yǎng)基中分離和純化的外泌體仍然含有大量的非外泌體成分，如微泡和凋亡小體等功能性囊泡的存在，可能會影響外泌體醫(yī)學(xué)應(yīng)用的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，不同的細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件和細(xì)胞的基因組變化也可能改變外泌體中的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此需要更加準(zhǔn)確、規(guī)范、快速、特異的分離純化方法和液體活檢技術(shù)對其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化。作為一種內(nèi)源性的納米載體，低免疫原性和天然的靶向及歸巢能力，天然的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)生物物質(zhì)的機(jī)制，使外泌體作為藥物傳遞平臺具有廣闊的前景。盡管多種載藥方式的探索，以及工程化修飾使外泌體用于靶向藥物遞送被廣泛研究，但如何影響外泌體的穩(wěn)定性、它們的細(xì)胞進(jìn)入途徑和體內(nèi)組織分布代謝仍有待闡明。作為高精度探針提供疾病提前診斷，具有靶向能力的藥物輸送體系，共同構(gòu)建用于體內(nèi)跟蹤、預(yù)后監(jiān)測和治療的外泌體多功能平臺將具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。