響應(yīng)面法優(yōu)化歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培養(yǎng)基大量元素配方1)

蔡正禹 文書生 田如男

(南京林業(yè)大學(xué),南京,210000)

歐洲冬青(IlexaquifoliumL.)別稱枸骨葉冬青,是冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(IlexL.)常綠小喬木或灌木,原產(chǎn)于歐洲南部、中部及西北部,為北極第三紀(jì)孑遺物種。歐洲冬青具有良好的生態(tài)適應(yīng)性,耐寒、病蟲害少,其葉片革質(zhì)光滑且四季常綠,冬季鮮紅的果實(shí)掩映在蒼翠的枝葉間,極為優(yōu)美,在園林中可孤植、作綠籬或盆栽。Ilexaquifolium‘Ferox Argentea’是歐洲冬青的選育品種,是一種新優(yōu)的彩色葉樹種,其葉色濃綠且具光澤,邊緣乳白色,葉片上表面及邊緣具尖刺,扭曲,新生枝紫色,且該品種具有較強(qiáng)的耐寒能力和生態(tài)適應(yīng)性,在園林綠化、盆栽以及切花生產(chǎn)中均具有很高的應(yīng)用價(jià)值。目前,歐洲冬青多采用播種和扦插繁殖,播種繁殖周期長、萌發(fā)率低[1],扦插繁殖系數(shù)較低[2]。離體快繁技術(shù)能夠克服上述傳統(tǒng)繁殖方法的缺陷,故研究建立歐洲冬青離體快繁技術(shù)體系是其產(chǎn)業(yè)化推廣的必然趨勢。

冬青屬離體快繁技術(shù)研究始于1994年[3],迄今國內(nèi)外學(xué)者已初步建立巴拉圭冬青、大葉冬青、大別山冬青等十余個冬青屬植物的離體快繁技術(shù)體系。然而,歐洲冬青的離體快繁技術(shù)研究仍存在諸多問題,Majada et al.[4]研究了植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant Growth Regulator,縮寫PGR)組合對其增殖和生長的影響,但增殖率低(1.35)、幼苗質(zhì)量差。此外,本課題組前期篩選了歐洲冬青‘Ferox Argentea’的增殖培養(yǎng)基種類和PGR組合,發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基效果最佳,最佳PGR組合為0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA,但增殖率仍不理想,僅為1.74。因此,如何提高增殖率是構(gòu)建歐洲冬青離體快繁技術(shù)體系面臨的首要問題,目前在冬青屬植物的離體快繁技術(shù)研究中,提高增殖率的方法僅局限于培養(yǎng)基類型和PGR組合的探索[5-8]。目前,基礎(chǔ)培養(yǎng)基礦物質(zhì)成分對試管苗的增殖和生長具有顯著影響[9],目前冬青屬植物在增殖培養(yǎng)階段主要使用WPM、MS、B5等模式培養(yǎng)基,但模式培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分并不能精準(zhǔn)滿足其生長發(fā)育需要,因此,通過篩選培養(yǎng)基成分構(gòu)建歐洲冬青的專用增殖培養(yǎng)基,是提高增殖率、解決其增殖難題的有效途徑。

響應(yīng)面試驗(yàn)法(RSM)是一種以數(shù)理統(tǒng)計(jì)為基礎(chǔ)并結(jié)合中心組合設(shè)計(jì)、全因素設(shè)計(jì)、Box-Behnken設(shè)計(jì)及單因素設(shè)計(jì)等試驗(yàn)設(shè)計(jì)方式進(jìn)行模型擬合并展開優(yōu)化分析,從而得到最優(yōu)研究方案的分析方式[10]。響應(yīng)面試驗(yàn)法因其試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、更直觀、精確度高、能體現(xiàn)多種因素間相互作用關(guān)系等優(yōu)勢,已被廣泛用于植物組織培養(yǎng)基優(yōu)化研究,如增殖培養(yǎng)PGR組合優(yōu)化[11-12]、增殖培養(yǎng)基大量元素配方篩選[13-14]等。目前,響應(yīng)面試驗(yàn)法在冬青屬植物的離體快繁技術(shù)研究中相關(guān)報(bào)道較少,本研究在課題組前期關(guān)于歐洲冬青離體快繁技術(shù)研究的基礎(chǔ)上[15],以歐洲冬青‘Ferox Argentea’試管苗為材料,應(yīng)用響應(yīng)面最佳優(yōu)化試驗(yàn)法對WPM培養(yǎng)基中5種大量元素?zé)o機(jī)鹽配方進(jìn)行優(yōu)化,以期構(gòu)建該品種專用的增殖培養(yǎng)基,為提高增殖率和建立該品種的增殖培養(yǎng)技術(shù)體系提供支撐,也為其他冬青屬植物的離體快繁技術(shù)研究提供新思路。

1 材料與方法

切取‘Ferox Argentea’試管苗芽叢上莖長≥1.0 cm的健壯單芽(切除葉片)作為試驗(yàn)材料。

將切取好的單芽接種于增殖培養(yǎng)基,添加0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA+蔗糖30.0 g/L+瓊脂6.5 g/L,pH=5.8。以WPM為基礎(chǔ)增殖培養(yǎng)基,并將其中5種大量元素?zé)o機(jī)鹽作為自變量設(shè)計(jì),質(zhì)量濃度范圍為原WPM培養(yǎng)基對應(yīng)各無機(jī)鹽質(zhì)量濃度0.5到3.0倍。利用Design-Expert響應(yīng)面最佳優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì),獲得32個試驗(yàn)組合,以原本W(wǎng)PM培養(yǎng)基大量元素?zé)o機(jī)鹽成分作為對照(表1)。每個處理設(shè)3次重復(fù),每次重復(fù)接種20株試管苗。增殖培養(yǎng)50 d后,統(tǒng)計(jì)試管苗的增殖率、株高、芽質(zhì)量等級,增殖率=總芽數(shù)/總株數(shù),株高為直尺測量試管苗根頸部到頂部之間的距離,芽質(zhì)量等級為主觀評價(jià),分為3級,分別為:3(莖粗壯、葉片伸展)、2(莖健壯、葉片細(xì)長)、1(莖細(xì)弱、葉片細(xì)小)。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表2)整理好導(dǎo)入Design-Expert 12.0中,擬合數(shù)據(jù)生成3個響應(yīng)值對應(yīng)的數(shù)學(xué)模型,通過數(shù)學(xué)模型運(yùn)算獲得優(yōu)化配方后,對該最優(yōu)處理進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),每次重復(fù)20株試管苗,50 d后統(tǒng)計(jì)平均增殖率、株高、芽質(zhì)量等級。

試驗(yàn)材料置于南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組培室培養(yǎng),培養(yǎng)溫度(25±1)℃,光照周期14 h/d,光照強(qiáng)度32.4 mol·m-2·s-1(熒光燈)。

表1 增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽最優(yōu)化試驗(yàn)水平

續(xù)(表1)

運(yùn)用Design-Expert 12.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。以增殖率、株高、芽質(zhì)量等級和愈傷組織為目標(biāo)函數(shù)建立模型,A、B、C、D和E分別代表K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O在增殖培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度倍數(shù)(原WPM培養(yǎng)基對應(yīng)各無機(jī)鹽質(zhì)量濃度倍數(shù)為1),對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、進(jìn)行主效應(yīng)分析與交互效應(yīng)分析,推斷各項(xiàng)生長指標(biāo)的最顯著影響因素。根據(jù)模型計(jì)算預(yù)測目標(biāo)值對應(yīng)各因素的置信區(qū)間,通過試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,獲得優(yōu)化配方。

2 結(jié)果與分析

按照表1進(jìn)行33組試驗(yàn),50 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得增殖率、株高和芽質(zhì)量等級試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2。由表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知,最佳增殖率處理為第7組,增殖率達(dá)到2.75;最佳株高處理為第22組,株高達(dá)到2.94 cm;最佳芽質(zhì)量處理為第7組,芽質(zhì)量等級達(dá)到2.89。綜合來看,第7組為試驗(yàn)處理中最優(yōu)組,增殖率、株高、芽質(zhì)量等級達(dá)到2.75、2.92 cm、2.89,全面優(yōu)于對照組(1.78、2.44 cm、1.78)。因此,可以確定培養(yǎng)基中無機(jī)鹽質(zhì)量濃度對歐洲冬青‘Ferox Argentea’存在顯著影響。但仍未能通過試驗(yàn)確定適合歐洲冬青‘Ferox Argentea’的最佳無機(jī)鹽質(zhì)量濃度配方,也無法分析各無機(jī)鹽質(zhì)量濃度和交互作用對歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖階段的影響,所以,進(jìn)一步通過Design Expert 12.0將表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析并擬合模型,得到以下因變量的模型,通過模型來分析各無機(jī)鹽質(zhì)量濃度和交互作用對歐洲冬青‘FeroxArgentea’增殖階段的影響。

2.1 增殖率模型構(gòu)建與檢驗(yàn)

通過Design Expert 12.0擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù),得出增殖率與增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽的二次多項(xiàng)式:

增殖率=2.179 21+0.003 862 19A+0.052 353 3B+

0.056 418 7C+0.115 309D+0.082 601 9E+

0.062 171AB-0.138 168AC-0.008 145 25AD-

0.120 646AE-0.062 162 6BC+0.019 928 8BD-

0.068 467 7BE+0.009 442 58CD+0.030 232 6CE+

0.112 949DE-0.073 374 1A2-0.011 262 4B2-

0.292 519C2+0.233 499D2-0.418 04E2。

(1)

通過Design Expert 12.0對增殖率-增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(F),結(jié)果顯示平方項(xiàng)E2對模型影響極顯著,線性項(xiàng)D、交互項(xiàng)AC和AE,平方項(xiàng)C2對模型影響顯著,各因素顯著性F值由大到小為F(NH4NO3)、F(Ca(NO3)2·4H2O)、F(KH2PO4)、F(MgSO4·7H2O)、F(K2SO4),大量元素?zé)o機(jī)鹽對增殖率的影響程度由大到小為NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4(表3)。具體影響:(1)NH4NO3對增殖率具有顯著影響,呈正線性相關(guān)(系數(shù)0.115 3);Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4對增殖率影響不顯著(圖1)。(2)K2SO4和KH2PO4的交互作用對增殖率具有顯著影響,系數(shù)為-0.138 2,K2SO4和KH2PO4的質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),增殖率下降;K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用對增殖率具有顯著影響,系數(shù)為-0.120 6,K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O的質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),增殖率下降(圖1F、圖1G)。(3)KH2PO4對增殖率影響不顯著,但平方項(xiàng)C2對模型影響顯著,系數(shù)為-0.292 5,隨著KH2PO4質(zhì)量濃度上升,增殖率先上升后下降(圖1C);Ca(NO3)2·4H2O對增殖率影響不顯著,但平方項(xiàng)E2對模型影響極顯著,系數(shù)為-0.418 0,隨著Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度上升,增殖率顯著先上升后下降(圖1E)。

表2 不同處理下增殖率、株高和芽質(zhì)量等級

表3 增殖率-增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽模型顯著性

因?yàn)槟Ｐ椭衅溆嘟换プ饔肍值較小,所以此處僅分析K2SO4-KH2PO4、K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O等4項(xiàng)交互作用,影響順序由大到小為K2SO4-KH2PO4、K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O(表3)。由圖2可知,K2SO4和KH2PO4、K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O濃度同時(shí)增大時(shí),增殖率皆為先上升后下降。隨著NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O濃度增大,增殖率增加。

2.2 株高模型構(gòu)建與檢驗(yàn)

通過Design Expert 12.0擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù),獲得株高與增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽的二次多項(xiàng)式:

株高=2.684 95+0.027 748 2A-0.038 126 1B+

0.066 424 4C+0.224 069D+0.161 806E+

0.012 344 3AB+0.039 522 5AC-0.105 483AD-

0.052 996AE+0.041 131 2BC+0.048 185 6BD-

0.062 998 3BE+0.009 050 38CD-0.159 046CE-

0.071 599 1DE+0.300 246A2-0.118 237B2-

0.274 574C2-0.100 789D2-0.186 869E2。

(2)

A.K2SO4-增殖率模型影響圖;B.MgSO4·7H2O-增殖率模型影響圖;C.KH2PO4-增殖率模型影響圖;D.NH4NO3-增殖率模型影響圖;E.Ca(NO3)2·4H2O-增殖率模型影響圖;F.K2SO4和KH2PO4交互作用-增殖率模型影響圖;G.K2SO4和Ca(NO3)2·4H2O交互作用-增殖率模型影響圖。圖中實(shí)線為擬合線性模型,虛線表示誤差區(qū)間,橫坐標(biāo)為對應(yīng)單因素,取值范圍0.5～3.0,縱坐標(biāo)為響應(yīng)值,取值范圍1.0～3.0,二元影響圖中,黑色線為左側(cè)指定無機(jī)鹽低質(zhì)量濃度時(shí)擬合模型,紅色線為高質(zhì)量濃度時(shí)擬合模型。

A.K2SO4-KH2PO4二元交互圖;B.K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖;C.MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖;D.NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖。x1軸、x2軸坐標(biāo)為左側(cè)對應(yīng)無機(jī)鹽的質(zhì)量濃度倍數(shù),取值范圍0.5～3.0,Z軸為對應(yīng)響應(yīng)值變化,變化區(qū)間1～3.0。

表4 株高-增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽模型顯著性

通過Design Expert 12.0對株高-增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果顯示線性項(xiàng)D對模型影響極顯著、線性項(xiàng)E和交互項(xiàng)CE,平方項(xiàng)A2對模型影響顯著,各因素顯著性F值由大到小為F(NH4NO3)、F(Ca(NO3)2·4H2O)、F(KH2PO4)、F(MgSO4·7H2O)、F(K2SO4),大量元素?zé)o機(jī)鹽對株高的影響程度由大到小為NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4(表4),具體表現(xiàn):(1)NH4NO3對株高具有極顯著影響,呈正線性相關(guān)(系數(shù)為0.224 1);Ca(NO3)2·4H2O對株高具有顯著影響,呈正線性相關(guān)(系數(shù)為0.161 8);KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2SO4對株高影響不顯著(圖3)。(2)KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用對株高影響顯著,系數(shù)為-0.159,隨著KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度增大,株高減小(圖3F)。(3)K2SO4不顯著,但平方項(xiàng)A2對模型影響顯著,系數(shù)為0.027 7,表示K2SO4質(zhì)量濃度增大時(shí),株高先降低后上升(圖3A)。

因?yàn)槟Ｐ椭衅溆嘟换プ饔肍值較小,所以此處僅分析MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O、K2SO4-NH4NO3、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O等4項(xiàng)交互作用,影響順序由大到小為KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O、K2SO4-NH4NO3、NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O、MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O(表4)。

A.K2SO4-株高模型影響圖;B.MgSO4·7H2O-株高模型影響圖;C.KH2PO4-株高模型影響圖;D.NH4NO3-株高模型影響圖;E.Ca(NO3)2·4H2O-株高模型影響圖;F.KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O交互作用-株高模型影響圖。

由圖4可知,MgSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用對株高影響較大,且兩者質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),株高先增加后下降。K2SO4和NH4NO3、NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用對株高影響較小,K2SO4和NH4NO3質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),株高先下降后增加,隨著NH4NO3和Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度增大,株高增加。

A.K2SO4-NH4NO3二元交互圖;B.MgSO4·7H2O-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖;C.KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖;D.NH4NO3-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖。

表4 芽質(zhì)量-增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽模型顯著性

2.3 芽質(zhì)量模型構(gòu)建與檢驗(yàn)

通過Design Expert 12.0擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù),獲得芽質(zhì)量與增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽的二次多項(xiàng)式:

芽質(zhì)量=2.500 86+0.019 872 7A-0.008 862 82B+

0.126 868C+0.324 12D+0.259 86E-0.190 116AB+

0.046 257 5AC-0.178 353AD+0.060 190 3AE+

0.036 158 4BC+0.122 05BD+0.109 91BE+

0.118 596CD-0.175 896CE-0.078 692 5DE+

0.041 223 5A2-0.008 298 39B2-0.340 861C2-

0.132 026D2-0.362 125E2。

(3)

通過Design Expert 12.0對芽質(zhì)量-增殖培養(yǎng)基5種大量元素?zé)o機(jī)鹽模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果顯示線性項(xiàng)D、E對模型影響極顯著,交互項(xiàng)AB、AD、CE和平方項(xiàng)C2、E2對模型影響顯著,各因素顯著性F值由大到小為F(NH4NO3)、F(Ca(NO3)2·4H2O)、F(KH2PO4)、F(K2SO4)、F(MgSO4·7H2O),大量元素?zé)o機(jī)鹽對芽質(zhì)量的影響程度由大到小為NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KH2PO4、K2SO4、MgSO4·7H2O(表5)。具體表現(xiàn):(1)NH4NO3對芽質(zhì)量具有極顯著影響,呈正線性相關(guān)(系數(shù)為0.324 1);Ca(NO3)2·4H2O對芽質(zhì)量具有極顯著影響,E2系數(shù)為-0.362 1,說明Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度增大時(shí),芽質(zhì)量先上升后下降;KH2PO4、K2SO4、MgSO4·7H2O對芽質(zhì)量影響不顯著(圖5)。(2)K2SO4和MgSO4·7H2O的交互作用、K2SO4和NH4NO3的交互作用和KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O的交互作用都對芽質(zhì)量影響顯著,系數(shù)為-0.190 1、-0.178 4和-0.175 9,兩種大量元素?zé)o機(jī)鹽質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),芽質(zhì)量均下降(圖5F、圖5G、圖5H)。(3)平方項(xiàng)C2對模型影響顯著,系數(shù)為-0.362 1,KH2PO4質(zhì)量濃度增大時(shí),試管苗的芽質(zhì)量先上升后下降(圖5C)。

A.K2SO4-芽質(zhì)量模型影響圖;B.MgSO4·7H2O-芽質(zhì)量模型影響圖;C.KH2PO4-芽質(zhì)量模型影響圖;D.NH4NO3-芽質(zhì)量模型影響圖;E.Ca(NO3)2·4H2O-芽質(zhì)量模型影響圖;F.K2SO4和MgSO4·7H2O4交互作用-芽質(zhì)量模型影響圖;G.K2SO4和NH4NO3交互作用-芽質(zhì)量模型影響圖;H.KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O交互作用-芽質(zhì)量模型影響圖。

因?yàn)槟Ｐ椭衅溆嘟换プ饔肍值較小,所以此處僅分析K2SO4-MgSO4·7H2O、K2SO4-NH4NO3、KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O等3項(xiàng)交互作用,影響順序由大到小為K2SO4-MgSO4·7H2O、K2SO4-NH4NO3、KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O(表5)。具體表現(xiàn):(1)MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度倍數(shù)為0.5～1.8倍時(shí),K2SO4質(zhì)量濃度單獨(dú)增大,芽質(zhì)量上升;MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度倍數(shù)為1.8～3.0時(shí),隨著K2SO4質(zhì)量濃度增大,芽質(zhì)量下降。K2SO4質(zhì)量濃度倍數(shù)為0.5～1.8時(shí),隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度增大,芽質(zhì)量上升;K2SO4質(zhì)量濃度倍數(shù)為1.8～3.0時(shí),隨著MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度增大時(shí),芽質(zhì)量下降。K2SO4和MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),芽質(zhì)量先上升后下降(圖6A)。(2)K2SO4質(zhì)量濃度倍數(shù)0.5～3.0之間,隨著NH4NO3質(zhì)量濃度增大時(shí),芽質(zhì)量上升并達(dá)到峰值。NH4NO3質(zhì)量濃度倍數(shù)為0.5～1.9時(shí),隨著K2SO4質(zhì)量濃度增大,芽質(zhì)量上升;NH4NO3質(zhì)量濃度倍數(shù)為1.9～3.0時(shí),隨著K2SO4質(zhì)量濃度增大,芽質(zhì)量下降。K2SO4和NH4NO3質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),芽質(zhì)量先上升后下降(圖6B)。(3)KH2PO4和Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度同時(shí)增大時(shí),芽質(zhì)量先上升后下降(圖6C)。

2.4 大量元素配方優(yōu)化及驗(yàn)證

本研究中對照組的增殖率、株高、芽質(zhì)量等級分別為1.78、2.44 cm、1.78,根據(jù)對增殖階段試管苗各生長指標(biāo)需求,將預(yù)測模型算法中3項(xiàng)響應(yīng)值增殖率、株高、芽質(zhì)量等級的重要程度由大到小設(shè)定為增殖率、株高、芽質(zhì)量,然后通過Design-Expert 12.0中上述(1)(2)(3)二次多項(xiàng)式模型綜合預(yù)測得到歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖階段大量元素?zé)o機(jī)鹽最優(yōu)配方質(zhì)量濃度倍數(shù)為:K2SO4=0.50,MgSO4·7H2O=1.43,KH2PO4=2.13,NH4NO3=3.00,Ca(NO3)2·4H2O=2.30,其增殖率、株高、芽質(zhì)量等級預(yù)測值分別為2.85、3.23 cm、2.89。對該最優(yōu)配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)際獲得增殖率、株高、芽質(zhì)量等級分別為2.91、3.14 cm、2.76,與預(yù)測值無顯著差異,并顯著優(yōu)于對照組(1.79、2.45 cm、1.78)(圖7)。

A.K2SO4-MgSO4·7H2O二元交互圖;B.K2SO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖;C.KH2PO4-Ca(NO3)2·4H2O二元交互圖。

A.增殖培養(yǎng)前,歐洲冬青‘Ferox Argentea’的健壯試管苗;B.試驗(yàn)生長表現(xiàn)最差組試管苗(第8組);C.預(yù)測最優(yōu)配方驗(yàn)證組試管苗;D.對照組試管苗(原WPM培養(yǎng)基)。

3 討論

3.1 單因素對歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培養(yǎng)的影響

本研究中NH4NO3對增殖率、株高、芽質(zhì)量等級影響顯著或極顯著,Ca(NO3)2·4H2O對株高、芽質(zhì)量等級影響顯著或極顯著。K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4在0.5～3.0質(zhì)量濃度倍數(shù)范圍內(nèi)對增殖率、株高、芽質(zhì)量等級影響不顯著。

在WPM培養(yǎng)基中,NH4NO3可提供具有生長調(diào)節(jié)作用的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮[16-17],對試管苗的不定芽、葉片以及節(jié)間產(chǎn)生影響[18]。本研究發(fā)現(xiàn),WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NH4NO3質(zhì)量濃度無法滿足歐洲冬青‘Ferox Argentea’試管苗的增殖和生長需求,提高WPM培養(yǎng)基中NH4NO3質(zhì)量濃度倍數(shù)至1.59～3.00倍,試管苗的增殖率、株高、芽質(zhì)量等級比對照組提升約35%～60%。目前,NH4NO3含量不足對試管苗增殖和生長的抑制作用已在諸多植物中報(bào)道,但是不同植物以及同種植物不同品種適宜的最佳質(zhì)量濃度存在較大差異,例如梨(Pyrusspp)最佳NH4NO3質(zhì)量濃度為1 416.00 mg·L-1、杏(PrunusarmeniacaL.)最佳NH4NO3質(zhì)量濃度為700.00 mg·L-1、榛子(CorylusheterophyllaFisch.)最佳NH4NO3質(zhì)量濃度為708.00 mg·L-1[19-21]。此外,過量的NH4NO3會抑制植物生長,例如過量的NH4NO3對榛子生長產(chǎn)生抑制作用,具體表現(xiàn)為增殖率降低和出現(xiàn)莖尖壞死[22]。本研究中0.5～3.0倍WPM培養(yǎng)基NH4NO3質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi),未發(fā)現(xiàn)抑制作用,通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),處理結(jié)果和響應(yīng)面預(yù)測值均得出NH4NO3質(zhì)量濃度倍數(shù)為3.0倍時(shí),試管苗增殖效果最佳,這可能是因?yàn)閃PM培養(yǎng)基配方中NH4NO3質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培養(yǎng)需求,所以在0.5～3.0倍質(zhì)量濃度區(qū)間內(nèi),未能發(fā)現(xiàn)NH4NO3的抑制作用。

Ca(NO3)2·4H2O在WPM培養(yǎng)基中提供部分硝態(tài)氮源[23-24]和植物生長所需的鈣離子,培養(yǎng)基中的鈣離子與植物生長具有密切關(guān)聯(lián)[25]。Akin et al.[26]在對榛子各品種進(jìn)行DKW培養(yǎng)基離子響應(yīng)面優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn),Ca2+離子和品種基因型對增殖率影響最大,Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度為原DKW培養(yǎng)基的1.5倍時(shí),榛子增殖效果最佳,而DKW培養(yǎng)基中Ca2+的質(zhì)量濃度約為WPM的3倍[27],這意味著WPM培養(yǎng)基中的Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度提高到原有的4.5倍才能使榛子增殖效果達(dá)到最佳。王新等[28]對鳳丹牡丹(PaeoniaostiiT.)增殖培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)提高Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度至WPM培養(yǎng)基原質(zhì)量濃度4倍時(shí),單株增殖系數(shù)由2.36增至3.07。但試管苗吸收過量的Ca2+也可能導(dǎo)致莖尖壞死[29]、增殖率降低,本研究中Ca(NO3)2·4H2O質(zhì)量濃度倍數(shù)達(dá)到2.30倍時(shí),各項(xiàng)響應(yīng)值達(dá)到最佳,超過2.302倍時(shí),響應(yīng)值開始下降,說明試管苗在Ca(NO3)2·4H2O高質(zhì)量濃度時(shí)會受到過量Ca2+的抑制。

3.2 交互作用對歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培養(yǎng)的影響

4 結(jié)論

培養(yǎng)基中鹽離子本身的質(zhì)量濃度以及離子之間的交互作用對植物生長發(fā)育影響顯著,然而,不同植物材料對離子交互效應(yīng)的響應(yīng)具有個體差異性,所以針對特定植物設(shè)計(jì)專用培養(yǎng)基可以有效解決一些植物的增殖困難技術(shù)問題[42-43]。本研究基于響應(yīng)面優(yōu)化法對WPM培養(yǎng)基的大量元素?zé)o機(jī)鹽成分進(jìn)行優(yōu)化,構(gòu)建了歐洲冬青‘Ferox Argentea’的專用增殖培養(yǎng)基,優(yōu)化配方為K2SO4495.00 mg·L-1、NH4NO31 200.00 mg·L-1、MgSO4·7H2O 529.10 mg·L-1、KH2PO4362.27 mg·L-1與Ca(NO3)2·4H2O 1 279.92 mg·L-1,其對應(yīng)WPM的大量元素?zé)o機(jī)鹽質(zhì)量濃度倍數(shù)分別為0.50、1.43、2.13、3.00和2.30倍。該優(yōu)化條件下,試管苗的增殖生長表現(xiàn)(增殖率2.91,株高3.34 cm,芽質(zhì)量等級2.76)顯著優(yōu)于對照組,其增殖率約為前人研究成果的1.5～2.0倍。本研究通過響應(yīng)面法最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建了高效的歐洲冬青‘Ferox Argentea’增殖培養(yǎng)技術(shù)體系,研究結(jié)果不僅能為該品種種苗規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐,還能為其他冬青屬植物增殖培養(yǎng)問題的解決提供新思路。