荊芥揮發(fā)油對內(nèi)毒素中毒模型小鼠的保護作用

溫桃群+桑文濤+徐鋒+王鳳+曾南

[摘要] 觀察荊芥揮發(fā)油對內(nèi)毒素（LPS）中毒模型小鼠的保護作用，并采用GC-MS對荊芥揮發(fā)油進行化學(xué)成分測定。雄性C57BL/6J小鼠按體重分層隨機分為空白對照組、模型對照組、地塞米松組（5 mg·kg^-1）、荊芥揮發(fā)油0.226 g·kg^-1及0.452 g·kg^-1劑量組。除地塞米松組實驗當日腹腔注射給藥一次外，其余各組小鼠連續(xù)灌胃給藥5 d，1次/d。各組末次給藥30 min后，除空白組小鼠外，其余各組小鼠腹腔注射LPS（15 mg·kg^-1）制備內(nèi)毒素中毒模型。造模12 h后，小鼠取血分離血清，采用ELISA及液相蛋白芯片技術(shù)測定炎癥因子IL-18，IL-1β，IL-5，TNF-α，單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1β），巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的水平；剖取肺臟、脾臟、胸腺稱重，計算臟器指數(shù)；取小鼠全血進行白細胞（WBC）、血小板（PLT）計數(shù)；同時進行各組小鼠肺組織病理組織學(xué)檢查。GC-MS檢測結(jié)果顯示薄荷酮、胡薄荷酮的相對質(zhì)量分數(shù)分別為46.67%，33.92%，二者質(zhì)量分數(shù)占總揮發(fā)油的80.59%。荊芥揮發(fā)油預(yù)防給藥，0.452，0.226 g·kg^-1劑量均能顯著降低模型小鼠血清IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF水平（P<0.01或P<0.05），荊芥揮發(fā)油0.452 g·kg^-1劑量亦降低血清IL-18，GM-CSF水平（P<0.01或P<0.05）；荊芥揮發(fā)油0.226 g·kg^-1劑量能使肺組織內(nèi)嗜中性粒細胞浸潤減少，顯示出良好抗炎效應(yīng)。但荊芥揮發(fā)油預(yù)防給藥，對模型小鼠白細胞計數(shù)的升高、血小板計數(shù)的減少及脾臟指數(shù)、肺指數(shù)的升高、胸腺指數(shù)的降低無明顯干預(yù)作用。結(jié)果表明，荊芥揮發(fā)油預(yù)防給藥對內(nèi)毒素（LPS）中毒模型小鼠有一定保護作用，作用發(fā)揮主要與抑制各類炎性細胞因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 荊芥揮發(fā)油；內(nèi)毒素中毒；保護作用；小鼠

[Abstract] In order to study the protective effects of Schizonepeta volatile oil （Sto）on endotoxin poisoning mice，and the relatively content of each chemical osubstance in Schizonepeta volatile oil was measured using GC-MS. The mare C57BL/6J mice were randomly divided into five groups including the normal group，model group，dexamethasone group （5 mg·kg^-1），and Sto （0.226 and 0.452 g·kg^-1，respectively） groups. The dexamethasone group was given the drugs once time by intraperitoneal injection on the 5th day，while the other mice were given drugs by oral administration once a day for 5 days. Then，the normal group was injected with the saline and the other groups were injected LPS （15 mg·kg^-1） after 30 minutes of the last administration. After LPS injection twelve hours，the blood，serum，and lung tissue of mice were collected. The IL-18，IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF，and GM-CSF were measured in serum by ELISA and Luminex Magpix. The white cell （WBC） and platelet （PLT） in blood were counted and lung，spleen，and thymus index were calculated. The lung histopathology was performed at the same time. The GC-MS results showed that the relative content of menthone and pulegone are 46.67% and 33.92%，respectively. The Sto （0.452 and 0.226 g·kg^-1，respectively） reduced the levels of IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，and M-CSF in serum （P<0.01 or P<0.05）. The 0.452 g·kg^-1 Sto also reduced the levels of IL-18 and GM-CSF in the serum （P<0.01 or P<0.05）. And the 0.226 g·kg^-1 Sto showed good anti-inflammatory effects by reducing neutrophil infiltration in the lung tissue. But the Sto had no effect on the increasing of WBC，spleen and lung index as well as decreasing of PLT and thymus index. The results showed that Sto has a protective effect in LPS-induced exdotoxin poisoning mice，its mechanism is related to inhibit the release of varies of inflammatory cytokines and reduce the inflammation reaction.

[Key words] Schizonepeta volatile oil；endotoxin poisoning；protective effects；mice

doi：10.4268/cjcmm20162425

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為內(nèi)毒素的主要成分，在多種疾病的病理進程中發(fā)揮重要作用，如感染性休克、多器官功能衰竭、發(fā)熱反應(yīng)、彌散性血管內(nèi)凝血等。荊芥為臨床常用辛溫解表藥之一，具有祛風解表、宣毒透疹、理血止痙之功效，多用于外感表證[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，荊芥抗炎、抗病毒作用良好，臨床常用于治療感冒發(fā)熱、 咽喉腫痛和皮疹、皮膚瘙癢等。前期研究已證明荊芥揮發(fā)油具有良好的抗炎作用，其作用的發(fā)揮與影響花生四烯酸代謝、抗氧化、抑制促炎因子生成等有關(guān)[2-8]。內(nèi)毒素作為細菌致病主要物質(zhì)，能激活單核-巨噬細胞系統(tǒng)，產(chǎn)生大量炎癥因子，而解表藥恰能通過發(fā)汗解表祛邪之功效發(fā)揮抗炎、抗菌、抗病毒的作用，因此本課題組采用LPS造模，觀察荊芥揮發(fā)油對模型小鼠的影響，以期進一步揭示和完善該提取部位的抗炎效應(yīng)與機制，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，體重18～22 g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（京）2012-0001，動物合格證號11400700130007。

1.2 受試物 荊芥購自成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室嚴鑄云教授鑒定，為唇形科植物荊芥Schizononepeta tenuifolia Briq.的地上部分。荊芥揮發(fā)油提取：按2015年版《中國藥典》第4部通則2204揮發(fā)油提取法中甲法提取，無水硫酸鈉充分脫水，得到淺黃色、透明油狀液體，密閉貯存于棕色瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆?，揮發(fā)油的提取率為0.61%（mL·g^-1），符合2015年版《中國藥典》荊芥含揮發(fā)油不得少于0.6%（mL·g^-1）的要求。GC-MS進行揮發(fā)油成分分析。實驗時用0.35%聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫-80）溶液配制使用，給藥劑量分別為其LD₅₀的1/10和1/5，即0.226，0.452 g·kg^-1。

1.3 試劑 地塞米松（Sigma，批號D-4902-25 mg）；LPS（Escherichia coil 055：B5，Lot#044 M4004V）購自Sigma公司。Mouse IL-18 ELISA kit，批號118018007，購自E-bioscience公司。MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel-Immunology Multiplex Assay，批號2683668，購自Millipore公司。

1.4 儀器 HP6890/5973GC/MS儀（美國Agilent）；3001型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific）；Luminex Magpix（液相懸浮芯片儀，美國Millipore ）；BS323S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；MEK-6318K全自動血液分析儀（日本Nihon Kohden公司）。

2 方法

2.1 荊芥揮發(fā)油的GC-MS測定 將荊芥揮發(fā)油樣本與色譜甲醇按50 μL∶2 mL進行混勻，然后采用0.22 μm尼龍篩網(wǎng)進行過濾，再裝入棕色瓶內(nèi)。將已處理好樣本按照以下條件進行檢測：HP-INNOWx色譜柱（0.53 mm×15 mm×50 m）；載氣He；流速1 mL·min^-1，柱初溫80 ℃，程序升溫10 ℃·min^-1至140 ℃，再程序升溫5 ℃·min^-1至200 ℃后，程序升溫25 ℃·min^-1至終溫260 ℃；電離方式EI，電離能70 eV；倍增器電壓330 V；掃描范圍20～450。質(zhì)譜標準譜庫為美國NIST，相對含量的確定為面積歸一化法。

2.2 荊芥揮發(fā)油對LPS中毒模型小鼠的影響 取健康C57BL/6J雄性小鼠，按體重分層隨機分為空白組、模型組、地塞米松（5 mg·kg^-1）組（即陽性對照組）、荊芥揮發(fā)油0.452，0.226 g·kg^-1組。除地塞米松組實驗當日腹腔注射給藥一次外，其余給藥組小鼠按0.02 mL·g^-1體積灌胃給藥，空白組與模型組給予等體積0.35%吐溫-80溶液，連續(xù)給藥5 d，1次/d，末次給藥30 min后，小鼠腹腔注射LPS（15 mg·kg^-1，0.01 mL·g^-1）造模，造模后12 h小鼠取血分離血清，采用ELISA試劑盒檢測血清IL-18水平，采用液相懸浮芯片儀檢測血清IL-1β，IL-5，TNF-α，單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），巨噬細胞炎性蛋白-1β（MIP-1β），巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）水平。另取小鼠全血 20 μL至裝有 2 mL稀釋液的 EP 管中，混勻，采用全自動血細胞分析儀測定白細胞計數(shù)。剖取小鼠脾臟、胸腺、肺臟稱重，計算臟器指數(shù)。將分離后的小鼠左肺固定于10%中性福爾馬林中，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理損傷。

2.3 數(shù)據(jù)處理 實驗過程中所產(chǎn)生數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用±s表示，各組數(shù)據(jù)間采用獨立樣本t檢驗分析檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 荊芥揮發(fā)油 GC-MS測定 從本實驗所用荊芥揮發(fā)油中分離出相對質(zhì)量分數(shù)0.5%以上的成分12個，其中薄荷酮相對質(zhì)量分數(shù)為46.67%，胡薄荷酮相對質(zhì)量分數(shù)為33.92%，二者質(zhì)量分數(shù)占總揮發(fā)油的80.59%，為揮發(fā)油主要組成成分。經(jīng)計算，本實驗揮發(fā)油樣品的胡薄荷酮質(zhì)量分數(shù)為0.207%，符合2015年版《中國藥典》所述胡薄荷酮（C₁₀H₁₆O）含質(zhì)量分數(shù)不得少于0.020%的規(guī)定。結(jié)果見表1。

3.2 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠全血白細胞與血小板計數(shù)、臟器指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組小鼠全血白細胞計數(shù)顯著增加（P<0.05），血小板計數(shù)顯著降低（P<0.05）；模型組脾臟指數(shù)、肺指數(shù)顯著升高（P<0.01或P<0.05），胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組對全血白細胞，血小板計數(shù)均無明顯影響作用；地塞米松組能顯著降低脾臟指數(shù)（P<0.01），其余各給藥組對臟器指數(shù)無明顯作用，見表2，3。

3.3 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠血清IL-18水平的影響 與空白組比較，模型組血清IL-18含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，荊芥揮發(fā)油0.452 g·kg^-1劑量顯著降低血清IL-18水平（P<0.01），見表4。

3.4 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠血清IL-1β，IL-5，TNF-α水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清IL-1β，IL-5，TNF-α 含量均顯著增加（P<0.01或P<0.05）；與模型組比較，荊芥揮發(fā)油0.452，0.226 g·kg^-1劑量組對此均有顯著對抗作用，能降低血清IL-1β，IL-5，TNF-α含量（P<0.01或P<0.05），見表5。

3.5 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠血清MCP-1，MIP-1β， M-CSF，GM-CSF水平的影響 與空白組相比，模型組血清中MCP-1，MIP-1β，M-CSF，GM-CSF均顯著增加（P<0.01或P<0.05）；荊芥揮發(fā)油0.452，0.226 g·kg^-1劑量組能顯著降低血清中MCP-1，MIP-1β，M-CSF水平（P<0.01或P<0.05）；荊芥揮發(fā)油0.452 g·kg^-1劑量組顯著降低血清中GM-CSF水平（P<0.05），見表6。

3.6 荊芥揮發(fā)油對模型小鼠肺組織病理組織學(xué)的影響 鏡下觀察可見，與空白組比較，造模組小鼠肺組織中肺泡隔內(nèi)嗜中性粒細胞浸潤明顯，肺泡膈有不同程度增厚，肺組織小血管內(nèi)充滿嗜中性粒細胞，肺泡膈增厚的主要原因為炎細胞浸潤造成。為了更直觀說明藥物對此病變程度的影響作用，實驗中對各造模組肺組織切片中肺泡膈和小血管內(nèi)嗜中性粒細胞的數(shù)量進行定量，評價方法：每葉肺400倍鏡下取上、中、下3張圖片，肺葉尖為上，支氣管進入處最下端為下，兩端之間為中部，每只動物取6張圖片，計數(shù)每張圖片上的嗜中性粒細胞數(shù)目，取其平均值作為該例標本嗜中性粒細胞的計數(shù)，并以此作為急性炎性反應(yīng)程度指標進行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計方法為SPSS 18.0方差分析。結(jié)果見表7，圖1，荊芥揮發(fā)油對內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的肺組織急性炎性細胞浸潤有減輕作用，其中0.226 g·kg^-1劑量組作用顯著（P<0.01）。

4 討論

內(nèi)毒素又名“致熱物質(zhì)”，為革蘭氏陰性菌細胞壁外膜特有成分，能夠直接或間接損傷肺泡-毛細血管屏障，導(dǎo)致毛細血管通透性增加，炎癥介質(zhì)釋放失控和中性粒細胞遷移，常見于感染性疾病和嚴重創(chuàng)傷中。內(nèi)毒素中毒是指內(nèi)毒素大量積聚于血液中，超過機體各自衛(wèi)系統(tǒng)的清除能力所導(dǎo)致的不同程度的內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素血癥進一步的發(fā)展可能引起膿毒性休克、彌散性血管內(nèi)凝血、急性呼吸窘迫綜合征等。脂多糖（LPS）作為內(nèi)毒素的主要成分，是重要的致病因素之一，在細菌繁殖或死亡時可釋放到細胞外發(fā)揮致病效應(yīng)[9]。由LPS所致的內(nèi)毒素中毒模型可表現(xiàn)出肺泡膈增厚，細胞成分增加，炎細胞浸潤等。大量研究發(fā)現(xiàn)，由LPS誘導(dǎo)的動物內(nèi)毒素中毒模型具有易于操作，可重復(fù)性好，不會引起多器官功能衰竭的特點，因此十分適用于藥物抗炎作用機制的研究。

IL-1β作為一種前炎性釋放因子，能誘導(dǎo)單核細胞趨化蛋白（MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白（MIP-1β）的產(chǎn)生。IL-18又名IFN-γ誘導(dǎo)因子，能誘導(dǎo)IFN-γ，細胞間黏附因子（ICAM-1），TNF-α等的產(chǎn)生。TNF-α可直接損傷肺血管內(nèi)皮細胞和激發(fā)中性粒細胞大量釋放炎性介質(zhì)，造成肺組織損傷[11]。有研究報道給予LPS刺激后，模型小鼠體內(nèi)IL-1β，IL-18，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF等促炎因子水平均明顯上升[12-16]。本實驗結(jié)果顯示，LPS所誘導(dǎo)的中毒模型小鼠血清中促炎因子IL-18，IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF，GM-CSF的水平均明顯升高，且肺組織內(nèi)中性粒細胞浸潤明顯，與文獻報道相符，表明造模成功。荊芥揮發(fā)油預(yù)防給藥，0.452，0.226 g·kg^-1劑量均能顯著降低血清IL-1β，IL-5，TNF-α，MCP-1，MIP-1β，M-CSF含量，0.452 g·kg^-1劑量同時能降低血清中IL-18，GM-CSF水平，表明荊芥揮發(fā)油能通過抑制大量促炎細胞因子的釋放來減輕模型小鼠的炎性損傷，是其抗炎機制之一。此外，病理學(xué)組織檢測發(fā)現(xiàn)，荊芥揮發(fā)油0.226 g·kg^-1劑量能使肺組織內(nèi)嗜中性粒細胞浸潤減少，顯示出良好抗炎效應(yīng)。

此外，實驗結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的中毒模型小鼠全血白細胞計數(shù)顯著增加，血小板計數(shù)明顯下降，脾臟指數(shù)、肺指數(shù)顯著升高，胸腺指數(shù)顯著降低，均體現(xiàn)出LPS對血液系統(tǒng)及器官組織的損傷表現(xiàn)，與文獻報道相符[15]，然而荊芥揮發(fā)油預(yù)防給藥對上述損傷表現(xiàn)的干預(yù)作用不明顯。

綜上，荊芥揮發(fā)油預(yù)防給藥對內(nèi)毒素中毒模型小鼠具有一定保護作用，主要是通過減輕炎癥反應(yīng)來發(fā)揮保護作用，作用機制與下調(diào)促炎因子的釋放，減輕炎性細胞浸潤有關(guān)。但其對于炎癥反應(yīng)相關(guān)信號通路的影響有待進一步探討。

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[責任編輯 馬超一]