纖維素酶酶解改性玉米粉工藝研究

張萌 張雨彤 王雪松 王巖

摘要：為探索酶法改性玉米粉技術(shù)，得到纖維素酶水解玉米粉的最佳酶解條件，以新鮮玉米粉為原料，研究酶濃度、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)使最適酶解條件更優(yōu)質(zhì)，并通過(guò)掃描電鏡比較微觀結(jié)構(gòu)的變化。經(jīng)研究，纖維素酶酶解玉米粉最適酶解條件為酶解pH 5.31，酶解溫度52.04 ℃，酶解時(shí)間4.28 h，纖維素酶濃度0.77％，此條件下還原糖含量為93.605 mg/mL。掃描電鏡結(jié)果表明，纖維素酶酶解玉米粉，使玉米蛋白質(zhì)和淀粉結(jié)合松散，結(jié)構(gòu)更易于被破壞。該結(jié)果可為玉米粉的進(jìn)一步改性提供基礎(chǔ)原料，并對(duì)酶法改性玉米粉技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米粉；纖維素酶；響應(yīng)面法；改性；還原糖

中圖分類(lèi)號(hào)：TS213.4? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）04-0120-07

Abstract： In order to explore the technology of enzymatic hydrolysis modification of corn flour and obtain the optimum enzymatic hydrolysis conditions of corn flour hydrolyzed by cellulase， with fresh corn flour as the raw material， the effects of enzyme concentration， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis time on the content of reducing sugar are studied.The optimum enzymatic hydrolysis conditions are made better by single factor experiment and response surface experiment， and the changes of microstructure are compared by scanning electron microscope.The results show that the optimal conditions for enzymatic hydrolysis of corn flour by cellulase are pH 5.31， enzymatic hydrolysis temperature 52.04 ℃， enzymatic hydrolysis time 4.28 h and cellulase concentration 0.77%. The reducing sugar content under these conditions is 93.605 mg/mL. Scanning electron microscope results show that the enzymatic hydrolysis of corn flour by cellulase makes the combination of corn protein and starch loose and the structure more easily to destroy. This result can provide basic raw materials for the further modification of corn flour and theoretical basis for the technology of enzymatic hydrolysis modification of corn flour.

Key words： corn flour; cellulase; response surface method; modification; reducing sugar

我國(guó)玉米的生產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界前列[1-2]。在我國(guó)糧食產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，玉米精深加工業(yè)占有重要地位，深加工產(chǎn)品主要集中在玉米淀粉、燃料、動(dòng)物飼料等方面[3-5]。玉米精深加工業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，也存在產(chǎn)業(yè)鏈延伸不足、深加工價(jià)值高、功能性關(guān)鍵技術(shù)缺乏等制約優(yōu)質(zhì)發(fā)展的瓶頸[6]。

鑒于玉米直接作為食品僅占其產(chǎn)量的5%這一客觀問(wèn)題，從玉米粉微觀結(jié)構(gòu)著手，通過(guò)玉米粉改性技術(shù)使玉米在食品中的應(yīng)用范圍擴(kuò)大，并進(jìn)行玉米主食工業(yè)化開(kāi)發(fā)，是對(duì)玉米深加工產(chǎn)業(yè)有利的補(bǔ)充和延展[7-9]。 在主食化開(kāi)發(fā)過(guò)程中，由于玉米粉中的蛋白質(zhì)、淀粉、營(yíng)養(yǎng)組成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特性，使玉米粉的食用品質(zhì)不盡如人意。為了提高玉米粉的加工和食用品質(zhì)，Graham等 [10]利用物理法、化學(xué)法和生物法等手段進(jìn)行了不同方式的研究，其中生物法對(duì)玉米粉改性是目前報(bào)道的效果最好且最常用的方法[11-12]。

李姝睿等[13]選擇枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）胞外酶對(duì)玉米淀粉進(jìn)行改性研究，經(jīng)過(guò)研究得出，一方面，經(jīng)酶改性后淀粉顆粒表面有明顯的酶作用孔隙，但淀粉顆粒的晶型沒(méi)有改變。另一方面，酶的作用會(huì)對(duì)玉米粉中的淀粉、蛋白質(zhì)等主要成分產(chǎn)生影響，但這些變化會(huì)導(dǎo)致玉米粉的食用品質(zhì)和加工品質(zhì)發(fā)生變化，其產(chǎn)品還需要進(jìn)一步研究。

纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要成分，占玉米粉總質(zhì)量的10%左右。其化學(xué)性質(zhì)不活潑，結(jié)構(gòu)單元的分子間力極強(qiáng)，由于分子內(nèi)氫鍵的存在，使本就相連的糖苷鍵無(wú)法旋轉(zhuǎn)，進(jìn)而使纖維素的剛性顯著增強(qiáng)[14-15]。纖維素的存在會(huì)直接影響玉米粉的改性加工過(guò)程，阻礙酶與淀粉和蛋白質(zhì)在空間上的接觸幾率，從而影響主食產(chǎn)品制作過(guò)程和產(chǎn)品品質(zhì)[16-18]。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)纖維素酶存在影響玉米粉改性過(guò)程、影響消化吸收的問(wèn)題，選擇纖維素酶，部分降解玉米粉中纖維素，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，以還原糖量的變化為指標(biāo)，研究各因素對(duì)玉米粉還原糖含量的影響，然后通過(guò)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)纖維素酶酶解玉米粉的最佳工藝條件進(jìn)行確定，研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化酶法改性玉米粉的微觀結(jié)構(gòu)提供了參考，為玉米粉進(jìn)一步加工利用提供了原料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

精制玉米粉：齊齊哈爾市恒昌玉米種植專(zhuān)業(yè)合作社；纖維素酶：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；食用堿：市售。

鹽酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

722S可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司； CT-C-IA熱風(fēng)循環(huán)烘箱 常州市佳騰干燥制粒設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市榮華儀器制造有限公司；FE28 pH計(jì) 梅特勒托利多公司；臺(tái)式微量高速離心機(jī) 華日機(jī)械有限公司；攪拌機(jī) 日本日立株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶改性玉米粉的方法

將100 g玉米粉與300 mL蒸餾水混合均勻，放入一定溫度的水浴鍋里，用攪拌器進(jìn)行攪拌，待攪拌平穩(wěn)后，調(diào)到一定pH 值，加入酶，每隔30 min調(diào)到一定的pH取樣，離心，取1 mL上清液，加入3 mL DNS（3，5-二硝基水楊酸溶液），100 ℃水浴15 min，在550 nm處測(cè)定吸光值[19-20]。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

在纖維素酶酶解玉米粉的工藝條件下，固定酶解pH為7，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2.5 h，酶濃度為0.1%（質(zhì)量比），研究各因素對(duì)還原糖含量的影響。

1.3.2.1 酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響

以酶解pH為7，酶解溫度為50 ℃，酶濃度為0.1%（質(zhì)量比），研究酶解時(shí)間（1～4 h）對(duì)還原糖含量的影響。

1.3.2.2 酶解溫度對(duì)產(chǎn)生還原糖含量的影響

以酶解pH為7，酶濃度為0.1%（質(zhì)量比），酶解時(shí)間為2.5 h，研究酶解溫度（30～70 ℃）對(duì)還原糖含量的影響。

1.3.2.3 酶解pH對(duì)還原糖含量的影響

以酶解溫度為50 ℃，酶濃度為0.1%（質(zhì)量比），酶解時(shí)間為2.5 h，研究酶解pH（3～7）對(duì)還原糖含量的影響。

1.3.2.4 酶濃度對(duì)還原糖含量的影響

以酶解pH為7，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2.5 h，研究酶濃度0.1%～1.0% （質(zhì)量比）對(duì)還原糖含量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在采用單因素實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件，基于 Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以A（酶解時(shí)間）、B（酶濃度）、C（酶解溫度）、D（酶解pH）為自變量，以還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，具體的實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.4 酶改性玉米粉微觀形貌觀察

用導(dǎo)電膠帶將適量的待測(cè)玉米粉粘貼在樣品臺(tái)后，置于掃描電子顯微鏡的載物臺(tái)上，并不斷放大至500，1 500，2 000，3 000倍，對(duì)樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)玉米粉還原糖含量的影響

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，還原糖含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為0～2 h時(shí)，還原糖含量穩(wěn)定增加，2～2.5 h增加較快，但4 h時(shí)還原糖含量與2.5 h時(shí)還原糖含量相差不大，可能是由于底物濃度是一定的，所以在2.5 h時(shí)底物已經(jīng)基本水解完全，從實(shí)際生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，選定酶解時(shí)間為2.5 h進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[21]。

2.1.2 酶濃度對(duì)玉米粉還原糖含量的影響

由圖2可知，隨著纖維素酶濃度的增加，還原糖含量也逐漸增加，當(dāng)纖維素酶的添加濃度為0.1%～0.75%時(shí)，還原糖含量緩慢增加，從0.75%開(kāi)始急速增加，酶濃度達(dá)到1.0％時(shí)，還原糖含量最高。一方面可能是由于酶的濃度越高，可以酶解出更多的還原糖；另一方面可能是由于水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，淀粉糊化導(dǎo)致總糖含量升高。當(dāng)纖維素酶濃度為0.1%時(shí)，還原糖含量相對(duì)較高。根據(jù)在實(shí)際生產(chǎn)中節(jié)約成本的原則，選擇0.1%的酶濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[22]。

2.1.3 酶解溫度對(duì)玉米粉還原糖含量的影響

酶的催化效率會(huì)受溫度變化的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，還原糖含量呈先升后降的趨勢(shì)。還原糖含量最高時(shí)的溫度為60 ℃。這是因?yàn)槔w維素酶的活性會(huì)隨著溫度的降低而受到抑制，溫度升高到一定程度會(huì)導(dǎo)致酶失活，所以得到還原糖量很少，表明溫度對(duì)酶具有雙重作用[23]。所以，選擇酶解溫度為50 ℃進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 酶解pH對(duì)玉米粉還原糖含量的影響

pH會(huì)影響纖維素酶的活性，pH過(guò)酸或者過(guò)堿都可能導(dǎo)致纖維素酶的活性降低。

由圖4可知，隨著pH的增加，還原糖含量出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，達(dá)到最大值時(shí)的pH值為6。本次實(shí)驗(yàn)所確定的最佳pH為6[24]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.1? 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

以A（酶解時(shí)間）、B（酶濃度）、C（酶解溫度）、D（酶解pH）為自變量，以產(chǎn)生的還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)共29組。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2[25-26]。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到以A（酶解時(shí)間）、B（酶濃度）、C（酶解溫度）、D（酶解pH）為自變量，以產(chǎn)生的還原糖含量Y為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-435.031 04+32.383 62A+130.737 89B+74.954 93C+8.032 61×11.539 33AB-0.395 64AC-0.126 88AD-4.476 22BC-0.196 89BD-1.624 00E-0.03×CD-3.830 05A2-94.557 61B2-6.494 95C2-0.070 464D2。

回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，該模型的F值為15.65，P值＜0.000 1，表示該模型差異極顯著；失擬項(xiàng)的P值=0.156 9>0.05，不顯著，表示回歸模型可以接受；模型中B、A2、B2、C2，D2對(duì)還原糖含量的影響極顯著，A、D、AB對(duì)還原糖含量的影響顯著，C、AC、AD、BC、BD、CD對(duì)還原糖含量的影響不顯著。根據(jù)F值和P值，各因素對(duì)還原糖含量的影響大小為酶濃度＞酶解pH＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。模型決定系數(shù)R2=0.939 9，該模型可用于分析和預(yù)測(cè)由纖維素酶酶解玉米粉產(chǎn)生的還原糖。

2.2.3 響應(yīng)面分析

由圖5可知，時(shí)間不變，還原糖含量隨著酶濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)；當(dāng)酶濃度恒定時(shí)，時(shí)間在1～6 h范圍內(nèi)變化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量逐漸增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量趨于平緩且有下降趨勢(shì)。

由圖6可知，時(shí)間不變，隨著pH值的逐步增加，還原糖含量逐步增加，當(dāng)pH值達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量開(kāi)始下降，這是由于pH會(huì)影響纖維素酶的活性，纖維素酶在中性或是偏堿性的溶液中有更好的溶解性，pH過(guò)酸或者過(guò)堿都可能導(dǎo)致纖維素酶的活性降低；當(dāng)pH值不變時(shí)，時(shí)間在1～6 h范圍內(nèi)變化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量隨之增加，而當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。

由圖7可知，時(shí)間不變，隨著溫度的升高，還原糖含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，這是由于溫度過(guò)低會(huì)抑制纖維素酶活性，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活。當(dāng)溫度不變時(shí)，延長(zhǎng)時(shí)間，還原糖含量升高，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，還原糖含量趨于緩慢增加，并有下降趨勢(shì)。

由圖8可知，酶濃度一定時(shí)，隨著pH值的逐漸增加，還原糖含量逐漸增加，當(dāng)pH值達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量開(kāi)始下降；當(dāng)pH值不變時(shí)，酶濃度在0.1%～1.0%范圍內(nèi)變化，升高纖維素酶濃度的同時(shí)，還原糖含量也逐漸增加?？赡苁怯捎诿傅臐舛仍礁?，可以酶解出更多的還原糖，還可能是由于水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，淀粉糊化導(dǎo)致總糖含量升高。

由圖9可知，當(dāng)溫度恒定時(shí)，隨著酶濃度的逐漸增加，還原糖含量逐漸增加，當(dāng)酶濃度恒定時(shí)，溫度在30～80 ℃范圍內(nèi)變化，還原糖含量隨溫度的升高而明顯增加，當(dāng)溫度達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量下降趨勢(shì)十分明顯。

由圖10可知，溫度一定時(shí)，隨著pH值的逐步增加，還原糖含量逐步增加，當(dāng)pH值達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量呈下降趨勢(shì)；當(dāng)pH值不變，溫度在30～80 ℃范圍內(nèi)變化，隨著溫度的升高，還原糖含量也逐漸增加，溫度達(dá)到一定值時(shí)，還原糖含量呈下降趨勢(shì)。

由圖5～圖10可知，酶濃度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)還原糖含量的影響較大，其中對(duì)還原糖含量影響最大的是酶濃度，曲線較陡，其次是酶解pH、酶解時(shí)間和酶解溫度，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.4 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化測(cè)試產(chǎn)生最佳條件：酶解pH 5.31，酶解溫度52.04 ℃，酶解時(shí)間4.28 h。纖維素酶的濃度為0.77％，做一組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的最佳還原糖含量對(duì)比。以上述最佳條件實(shí)際測(cè)得還原糖含量為93.605 mg/mL，模型預(yù)測(cè)值為94.289 mg/mL，誤差為0.7%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，說(shuō)明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)還原糖含量。

2.3 酶改性對(duì)玉米粉微觀形態(tài)的影響

由圖11和圖12可知，玉米中的纖維素會(huì)減弱外界條件對(duì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，在纖維素酶處理后淀粉和蛋白質(zhì)的結(jié)合體明顯出現(xiàn)松散和形態(tài)變化。原玉米粉粒徑較大，大小差異顯著，質(zhì)地緊密，無(wú)明顯裂紋和溝壑，較小顆粒存在少量微小孔洞，這是由于玉米粉中蛋白質(zhì)和淀粉的緊密結(jié)合造成的，經(jīng)纖維素酶處理之后，玉米粉表面出現(xiàn)明顯的溝壑和裂紋，可能是由于在纖維素處理后，改變了玉米粉中蛋白質(zhì)和淀粉的結(jié)合方式，促進(jìn)了淀粉的溶脹。仍呈現(xiàn)不規(guī)則的立體結(jié)構(gòu)，較大粒徑玉米粉數(shù)量下降，大顆粒玉米粉坍塌成小顆粒，且較小顆粒表面孔洞數(shù)量明顯高于原玉米粉。

3 討論

玉米曾經(jīng)一度是我國(guó)民眾重要的食物來(lái)源，然而伴隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展，人們對(duì)待食品方面的要求更加嚴(yán)格，玉米的加工水平以及食用效果差等讓玉米食品漸漸離開(kāi)人們的主食桌?，F(xiàn)階段，依托科技含量更高的現(xiàn)代加工手段來(lái)達(dá)到改善口感、增強(qiáng)品質(zhì)的效果是實(shí)現(xiàn)玉米深加工研究工作的重難點(diǎn)。

現(xiàn)階段玉米粉的生物改性主要是依靠微生物發(fā)酵或者是生物酶水解的方式對(duì)玉米粉內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)修飾處理，進(jìn)而使得玉米粉的黏性以及保水力等特性得以優(yōu)化。王景會(huì)等采用生物酶對(duì)玉米粉進(jìn)行修飾改性，發(fā)現(xiàn)改性可減少玉米粉中的總淀粉和蛋白含量，增加溶解度和直鏈淀粉含量，從而改善玉米面團(tuán)的品質(zhì)。田益玲等研究表明，當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度為80 mg/kg時(shí)，25 ℃浸泡6 h可以使玉米粉的品質(zhì)得到提高。王富盛等采用復(fù)合酶對(duì)玉米粉進(jìn)行改性后發(fā)現(xiàn)，單一酶對(duì)玉米粉的改性程度有限，多酶復(fù)合改性可以改善玉米粉的黏彈性和延展性。

雖然和多種酶復(fù)合水解玉米粉的結(jié)果相比會(huì)有差距，但在玉米粉加工過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)忽視纖維素對(duì)玉米粉加工利用的影響，所以本實(shí)驗(yàn)以還原糖含量為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶水解玉米粉關(guān)鍵工藝條件，最終確定其酶解工藝條件。

4 結(jié)論

利用響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶酶解玉米粉的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件：酶解pH為5.31，酶解溫度為52.04 ℃，酶解時(shí)間為4.28 h，纖維素酶濃度為0.77％。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的還原糖含量為93.605 mg/mL，模型預(yù)測(cè)值為94.289 mg/mL，相對(duì)誤差為0.7%，酶解效果較好。通過(guò)纖維素酶對(duì)玉米粉進(jìn)行改性，改善玉米粉的結(jié)構(gòu)，從而使玉米粉微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使玉米粉中的淀粉和蛋白質(zhì)等成分充分暴露，更易受到外界條件的影響，為復(fù)合酶改性玉米粉提供了原料，有利于玉米粉的應(yīng)用。但未考慮到加熱條件是否會(huì)對(duì)還原糖的含量造成一定的影響，以及淀粉糊化對(duì)玉米粉的結(jié)構(gòu)會(huì)不會(huì)造成影響。由于玉米中纖維素含量較少，多數(shù)學(xué)者可能會(huì)忽視纖維素對(duì)玉米粉加工的影響。采用纖維素酶將玉米粉中的纖維素降解，為玉米粉加工提供了一定的數(shù)據(jù)參考。

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