肉桂精油納米乳的制備及抗菌活性研究

趙電波 王少丹 王雯雯

摘要：肉桂精油具有良好的抗菌和抗氧化特性，由于存在揮發(fā)性強(qiáng)、水溶性差等問題，制約了其在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用。研究證實(shí)，納米乳化技術(shù)能夠有效提高精油的水溶性及穩(wěn)定性。文章以殼聚糖與果膠為壁材制備肉桂精油納米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON），并評價了其抗菌活性。結(jié)果表明，超聲波法制備CON的最優(yōu)參數(shù)：肉桂精油添加量為1%～2%，殼聚糖與果膠的體積比為1∶1，超聲波處理時間為7.5 min，超聲波功率為450 W；制備的納米乳粒徑分布在10～150 nm，分散性及穩(wěn)定性最好；CON對大腸桿菌O157： H7（Escherichia coli O157：H7）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和假單胞菌CM2（P. deceptionensis CM2）的最小抑菌濃度分別為0.500，0.250，0.125 μL/mL，表明CON具有較好的抑菌活性。該研究結(jié)果將為CON在食品保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：肉桂精油；納米乳；制備；抗菌活性

中圖分類號：TS201.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0194-06

Abstract： Cinnamon essential oil has excellent antibacterial and antioxidant properties. The application of cinnamon essential oil in the field of food preservation is restricted because of its strong volatility and poor water solubility. Studies have confirmed that nano emulsification technology could effectively improve the water solubility and stability of essential oil. In this paper， cinnamon essential oil nanoemulsion （CON） is prepared with chitosan and pectin as the wall materials， and its antibacterial activity is evaluated. The results show that the optimal parameters for preparing CON by ultrasonic method are as follows： the addition amount of cinnamon essential oil is 1%～2%， the volume ratio of chitosan to pectin is 1∶1， the ultrasonic treatment time is 7.5 min， and the ultrasonic power is 450 W. The particle size distribution of the prepared nanoemulsion is 10～150 nm with the best dispersivity and stability. The minimum inhibitory concentrations of CON against Escherichia coli O157：H7， Listeria monocytogenes and P. deceptionensis CM2 are 0.500， 0.250， 0.125 μL/mL respectively， indicating that CON has good antibacterial activity. The results will provide theoretical basis and technical support for the application of CON in food preservation.

Key words： cinnamon essential oil; nanoemulsion; preparation; antibacterial activity

植物精油（essential oil，EO）是一種來源廣泛、安全環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性的天然抗菌劑[1－2]。常見的植物精油包括肉桂精油、牛至精油、丁香精油、孜然精油等[3]。肉桂精油（cinnamon essential oil，CEO）因具有廣譜抑菌性和抗氧化性，在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。但由于肉桂精油不溶于水、揮發(fā)性強(qiáng)且穩(wěn)定性較差，在一定程度上制約了其在食品中的應(yīng)用[4]。近年來，利用納米乳液包埋精油并應(yīng)用于食品的抗菌保鮮已有許多報(bào)道。精油納米乳不僅可以提高精油的穩(wěn)定性，減少其刺激性氣味，而且可以控制其釋放速率，延長作用時間[5]。制備精油納米乳的方法有很多，較為常見的是采用殼聚糖、果糖、明膠和黃原膠等多糖基載體對精油進(jìn)行包埋[6]。例如，Huang等[7]采用高壓均質(zhì)法以明膠和殼聚糖溶液為壁材，以迷迭香提取物和ε-聚賴氨酸為芯材，制備了一種水包油型復(fù)合納米乳，經(jīng)納米乳涂膜處理后，即食燒雞的貨架期與未處理組相比顯著延長6 d。Liu等[8]采用高速剪切技術(shù)制備了薄荷精油納米乳，通過條件優(yōu)化確定最佳納米乳配方為薄荷精油10%、表面活性劑8%、去離子水82%（質(zhì)量比）。

目前，已有研究報(bào)道采用超聲波法制備香茅精油[9]、牛至精油[10]和亞麻籽油[11]納米乳，但鮮有報(bào)道采用超聲波法制備多糖基肉桂精油納米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON）。殼聚糖和果膠是天然的堿性多糖，無毒無害，具有良好的生物相容性和可降解性[12－13]。因此，本研究選用殼聚糖和果膠作為載體包埋肉桂精油制備納米乳，探究兩種多糖的添加量對CON穩(wěn)定性的影響并對其進(jìn)行表征及抗菌活性研究，旨在制備穩(wěn)定性良好且抑菌性強(qiáng)的CON，并為其應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；假單胞菌CM2（Pseudomonas deceptionensis CM2）菌株：由本實(shí)驗(yàn)室分離自腐敗雞肉；殼聚糖、果膠、肉桂精油：上海源葉生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）：北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Tween 80、無水乙醇、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、冰乙酸：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Centrifuge 5424R型低溫高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；Discovery HR-1型旋轉(zhuǎn)流變儀 美國Waring公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；VC750型超聲波破碎儀 美國Sonic公司； Ultraturrax T25型高速分散器 德國IKA公司；MQD-S2R型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；Bioscreen C型全自動微生物生長曲線系統(tǒng) 芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；Turbiscan Lab Measuring Expert型多重光散射儀 法國Formulaction儀器公司；Nano-ZS90型納米激光粒度儀 英國Malvern儀器公司；SevenGo Duo型pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo儀器有限公司；Tecan Spark 20M型多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備

用無菌接種環(huán)分別挑取活力旺盛的E. coli O157：H7、L. monocytogenes和P. deceptionensis CM2單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，于30～37 ℃、150 r/min搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。取25 mL培養(yǎng)物于50 mL離心管中，離心（4 ℃，8 000×g，10 min），棄上清液，收集菌體。用無菌NaCl溶液（0.90%，質(zhì)量和體積比）洗滌菌體2次，離心同上。將所得菌體重懸于磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）中，混勻，測量菌懸液的OD600值，調(diào)整OD600值介于1.2～1.4之間，制成活菌數(shù)約為8 lg CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.2 CON的制備

參考He等[14]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。稱取0.6 g殼聚糖粉末溶于100 mL乙酸溶液（0.5%，體積比）中，室溫下磁力攪拌2 h得到殼聚糖溶液（0.6%，質(zhì)量和體積比）。稱取1.0 g果膠粉末溶于100 mL蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2 h得到果膠溶液（1%，質(zhì)量和體積比）。將殼聚糖溶液和果膠溶液按一定的體積比混合，作為乳液基質(zhì)，然后將肉桂精油加入基質(zhì)溶液中，再加入吐溫80作為乳化劑，吐溫80與精油的比例為1∶4，磁力攪拌20 min至分散均勻，然后用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，形成粗乳液。通過超聲波設(shè)備進(jìn)一步均質(zhì)乳化即得CON，于4 ℃冷藏備用。

1.3.3 CON制備條件優(yōu)化

對殼聚糖和果膠的不同比例、超聲功率和超聲時間對CON性質(zhì)的影響進(jìn)行分析，通過測定CON的平均粒徑、多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）、Zeta-電位、Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù)（Turbiscan stability index，TSI）、黏度等確定制備殼聚糖-果膠基CON的最優(yōu)條件。

1.3.3.1 殼聚糖和果膠的比例

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將殼聚糖溶液和果膠溶液分別按0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、1∶4（體積比）混合，然后將肉桂精油（1.5%，體積比）和吐溫80加入到不同比例的殼聚糖和果膠溶液中，吐溫80與精油的比例為1∶4（體積比），磁力攪拌20 min至分散均勻。用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，形成粗乳液。再采用超聲波設(shè)備（功率為450 W，時間為5 min，頻率為20 Hz）進(jìn)一步均質(zhì)乳化得到CON。分別測定CON的pH、粒徑、ζ-電位、流變特性（黏度）以及TSI。

1.3.3.2 超聲波功率

將殼聚糖溶液和果膠溶液按1∶1（體積比）混合，然后將肉桂精油（1.5%，體積比）和吐溫80加入到基質(zhì)溶液中，吐溫80與精油的比例為1∶4，磁力攪拌20 min至分散均勻。用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，形成粗乳液。再采用不同功率（0，150，300，450，600，750 W）的超聲波設(shè)備（頻率為20 Hz，時間為5 min）進(jìn)一步均質(zhì)乳化即得CON。測定CON的平均粒徑和PDI。

1.3.3.3 超聲波處理時間

將殼聚糖溶液和果膠溶液按1∶1（體積比）混合，然后將肉桂精油（1.5%，體積比）和吐溫80加入到基質(zhì)溶液中，吐溫80與精油的比例為1∶4，磁力攪拌20 min至分散均勻。用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，形成粗乳液。再采用超聲波設(shè)備（頻率為20 Hz，功率為450 W）進(jìn)一步均質(zhì)乳化，處理時間分別為0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 min，得到CON。測定CON的平均粒徑和PDI。

1.3.3.4 肉桂精油添加量

將殼聚糖溶液和果膠溶液按1∶1（體積比）混合，然后將肉桂精油（濃度分別為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%）和吐溫80加入到基質(zhì)溶液中，吐溫80與精油的比例為1∶4，磁力攪拌20 min至分散均勻。用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min，形成粗乳液。再采用超聲波設(shè)備（頻率為20 Hz，功率為450 W，時間為7.5 min）進(jìn)一步均質(zhì)乳化，得到CON。測定CON的平均粒徑和PDI。

1.3.4 pH的測定

采用SevenGo Duo型pH計(jì)測量CON的pH值。

1.3.5 平均粒徑、PDI和Zeta-電位的測定

用Nano-ZS90納米激光粒度儀測量CON的平均粒徑、PDI和Zeta-電位。取1 mL制備好的CON加入樣品槽中，平衡時間為2 min。

1.3.6 TSI的測定

參考Wang等[15]的測定方法，采用多重光散射儀測定CON的TSI值。取20 mL CON置于玻璃瓶中，確保無氣泡，在25 ℃下進(jìn)行穩(wěn)定性分析測試。每隔30 s掃描一次，總掃描時間為60 min。利用Turbiscan軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出樣品的TSI值。

1.3.7 黏度的測定

參考李可等[16]的方法并適當(dāng)修改，采用流變儀測定CON的黏度。取3 mL不同比例的殼聚糖和果膠制備的CON樣品均勻涂布于測試平臺上，用硅膠油密封以防止水分蒸發(fā)。測試溫度為25 ℃，夾縫間隙為1 mm，剪切速率為1～200 s-1。

1.3.8 抗菌活性的測定

采用抑菌圈法測定CON對E. coli O157：H7的抗菌活性。參考Kazempour-Samak等[17]的方法，將無菌圓濾紙片（d=8 mm）置于涂布了E. coli O157：H7菌液（濃度約為8 lg CFU/mL）的平板上，每個平板上放3片圓濾紙片，依次將10 μL的殼聚糖-果膠基質(zhì)溶液、粗乳液和CON（濃度為1%）垂直滴加到圓濾紙片上。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈的直徑。

1.3.9 MIC和MBC的測定

采用二倍稀釋法測定CON的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）。參考Du等[18]的方法并適當(dāng)修改，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的前三排每孔各加入100 μL NB培養(yǎng)基，然后在每排第1孔中加入100 μL CON（稀釋至肉桂精油濃度為8 μL/mL），用移液器吹打混勻后吸取100 μL混合溶液置于第2孔中，照此添加至第6孔，吸取第6孔中100 μL混合溶液棄去，然后在每孔中加入100 μL濃度約為6 lg CFU/mL的供試菌菌懸液，此時每孔CON中的肉桂精油濃度從左至右依次為2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.062 μL/mL。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于30～37 ℃培養(yǎng)48 h，通過多功能微孔板讀數(shù)儀觀察供試菌的生長情況，以完全沒有微生物生長的最低的肉桂精油濃度作為MIC。在測得MIC的基礎(chǔ)上，吸取100 μL上述無微生物生長的孔中的液體培養(yǎng)基涂布于平板上，于30～37 ℃培養(yǎng)24～48 h，以平板上無菌落生長的最低的肉桂精油濃度作為MBC。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Prism軟件（GraphPad 7.0）繪圖，采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間采用LSD多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖和果膠的比例對肉桂精油納米乳pH的影響

乳液的pH值在乳液體系的穩(wěn)定性中起著重要作用[19]，殼聚糖和果膠的比例對肉桂精油納米乳pH的影響見圖1。

由圖1可知，隨著殼聚糖和果膠比例的增大，CON的pH在3.80～3.65之間（P>0.05），說明CON的pH較穩(wěn)定。

2.2 殼聚糖和果膠的比例對CON粒徑和電位的影響

乳液粒徑的大小是評判納米乳液是否形成的標(biāo)準(zhǔn)，也是反映乳液體系分散性及穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。不同比例的殼聚糖與果膠對CON平均粒徑的影響見圖2中A。隨著殼聚糖和果膠比例的增大，CON的平均粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的變化趨勢。當(dāng)殼聚糖與果膠的比例為1∶0時，CON的粒徑最大，為40.21 nm；而當(dāng)殼聚糖與果膠的比例為1∶1時，CON的粒徑最小，為17.51 nm。

Zeta-電位反映了溶液中納米粒子表面電荷之間的相互作用，是影響納米乳液穩(wěn)定性的重要參數(shù)之一，Zeta-電位絕對值越大，說明乳液體系越穩(wěn)定[20]。由圖2中B可知，殼聚糖與果膠的比例顯著影響CON的Zeta-電位。單獨(dú)添加殼聚糖時CON具有較高的正電位（+59 mV），而單獨(dú)添加果膠時則為負(fù)電位（－3 mV），這主要是由殼聚糖和果膠自身所帶電荷決定的。殼聚糖是陽離子多糖，分子含有帶正電荷的氨基；而果膠是陰離子多糖，分子含有帶負(fù)電荷的羧基[21]。Zeta-電位隨著果膠添加量的增加而降低，這可能是由于殼聚糖和果膠之間相反的電荷發(fā)生了中和反應(yīng)。當(dāng)殼聚糖與果膠的比例為1∶1時，CON的Zeta-電位為+32 mV，乳液較穩(wěn)定。綜上，當(dāng)殼聚糖與果膠的比例為1∶1時，CON的粒徑最小，Zeta-電位值相對較大，穩(wěn)定性較好。

2.3 殼聚糖和果膠的比例對CON流變特性和穩(wěn)定性的影響

乳液黏度的變化反映了分子間力的變化，分子間相互作用力越強(qiáng)，乳液黏度越大[22]。由圖3中A可知，在剪切速率范圍（0～100 s-1）內(nèi)，CON的黏度隨著剪切速率的增加先迅速下降后趨于平緩，出現(xiàn)剪切稀化現(xiàn)象，表現(xiàn)為假塑性流體，這與王忠琨等[23]的研究結(jié)果基本一致。此外，CON的流變特性受果膠添加量的影響，果膠添加量越多，黏度越大，殼聚糖與果膠的比例為1∶0時，CON黏度最小，其次是1∶1。一般情況下，黏度越小，說明CON越均勻細(xì)膩，流動性越強(qiáng)。

乳液在放置過程中可能會出現(xiàn)乳析、絮凝或聚結(jié)等情況，TSI可以評價乳液的穩(wěn)定性，一般來說，TSI曲線斜率和數(shù)值越小表示乳液發(fā)生分離的速度越慢，乳液穩(wěn)定性越好；TSI越大，乳液穩(wěn)定性越差[24]。由圖3中B可知，CON的TSI值隨著時間的延長呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，說明在1 h內(nèi)納米乳液的穩(wěn)定性不斷下降。當(dāng)殼聚糖與果膠的比例為0∶1時，TSI值在1 h內(nèi)急劇升高，說明此比例下乳液極不穩(wěn)定；殼聚糖與果膠的比例為1∶1時，CON的TSI值最低，說明在該比例下CON的穩(wěn)定性最好。

2.4 超聲功率和超聲時間對CON粒徑和PDI的影響

超聲波可用于制備具有小液滴尺寸和高穩(wěn)定性的納米乳[25]。由圖4中A可知，與未超聲處理組相比，超聲處理組CON的粒徑更小，分散性更好。隨著超聲功率從0 W增加到450 W，乳液粒徑從210.83 nm減小到24.03 nm；而超聲功率從450 W增加到750 W，乳液粒徑增加到34.60 nm。PDI是聚合物相對分子質(zhì)量分布寬度的量度，PDI值越小說明乳液體系越均勻[26]。隨著超聲功率從0 W增加到450 W，PDI從0.63減小至0.48；而從450 W增加到750 W，PDI增加至0.54。以上結(jié)果表明，經(jīng)功率為450 W的超聲波處理后，CON粒徑較小，分散性較好。由圖4中B可知，CON的平均粒徑和PDI隨著超聲時間的延長均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，在7.5 min時達(dá)到最小值。這可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚砜梢詫⑷橐褐械拇箢w粒破碎成細(xì)小的微粒，乳液粒徑降低，從而使其分散性更好，而超聲時間過長會導(dǎo)致物質(zhì)重新發(fā)生聚集，使其粒徑增大，這與Shao等[27]的研究結(jié)果一致。當(dāng)超聲時間為10 min時，平均粒徑和PDI值的變化與7.5 min相比差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，經(jīng)7.5 min的超聲波處理后，納米乳液能達(dá)到較穩(wěn)定的狀態(tài)。因此，綜合考慮，確定最佳的超聲功率為450 W，超聲時間為7.5 min。

2.5 肉桂精油添加量對CON粒徑、PDI和電位的影響

由表1可知，隨著肉桂精油添加量的增加，納米乳的粒徑不斷變小，當(dāng)添加量為0.25%時，粒徑為259.00 nm，而當(dāng)添加量增加至2%時，粒徑降低至19.74 nm，可能是因?yàn)榫吞砑恿康脑黾釉鰪?qiáng)了乳液界面膜的穩(wěn)定性和聚結(jié)力，這與Sun等[28]的研究結(jié)果一致。PDI值之間無顯著差異（P>0.05）。此外，Zeta-電位值隨著精油添加量的增加而不斷增加，當(dāng)精油添加量在1%～2%之間時，CON的Zeta-電位均大于30 mV，說明乳液較穩(wěn)定。綜上所述，肉桂精油添加量為1%～2%時，CON粒徑較小且穩(wěn)定性較好。

2.6 CON與粗乳液抗菌活性對比

采用瓊脂濾紙片擴(kuò)散法評價CON、粗乳液和多糖基質(zhì)的抑菌活性。由圖5可知，抑菌圈直徑的大小依次為納米乳液>粗乳液>多糖基質(zhì)，說明CON的抗菌活性優(yōu)于粗乳液和多糖基質(zhì)，這與蔣書歌[29]的研究結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)镃ON粒徑小且均一性高，使精油能夠更好地釋放，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抑菌效果。

2.7 CON的抗菌活性

由表2可知，CON對E. coli O157：H7、 L. monocytogenes和P. deceptionensis CM2的MIC為0.125～0.500 μL/mL，MBC為0.250～0.500 μL/mL。在3種測試菌株中，納米乳對P. deceptionensis CM2的抗菌活性最強(qiáng)，L. monocytogenes次之，E. coli O157：H7最弱，可能是由于不同菌株之間細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組成存在較大差異，這與王雪薇[30]的研究結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

綜上所述，采用超聲波法制備CON的最優(yōu)參數(shù)為殼聚糖與果膠的體積比1∶1、超聲時間7.5 min、超聲功率450 W、肉桂精油體積分?jǐn)?shù)1%～2%，在該條件下CON的平均粒徑主要分布在10～150 nm，Zeta-電位絕對值大于30 mV。通過抑菌圈對比，證明了CON的抑菌效果優(yōu)于粗乳液和多糖基質(zhì)，且CON對不同的測試菌株均具有較好的抑菌活性。在今后的研究中應(yīng)綜合運(yùn)用代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法系統(tǒng)闡明CON失活微生物的作用機(jī)制；此外，還應(yīng)系統(tǒng)評價CON對食品表面微生物的抑制效果及對食品營養(yǎng)、感官及貨架期等指標(biāo)的影響。

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