響應(yīng)面法優(yōu)化百香果果醋澄清的酶解工藝

盧珍蘭 龐永慧 龐情 李致寶

摘要：從蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、糖化酶4種酶中篩選出2種酶進行復(fù)合，對百香果果醋進行澄清處理，以百香果果醋透光率為參考指標，通過響應(yīng)面法優(yōu)化百香果果醋澄清的酶解工藝。結(jié)果表明，百香果果醋澄清的酶解工藝響應(yīng)面模型的建立具有穩(wěn)定性，最適澄清酶解工藝條件為復(fù)合酶配比（淀粉酶∶果膠酶）3∶2、復(fù)合酶添加量145 mg/kg、澄清溫度46.5 ℃、澄清時間125 min。在此優(yōu)化工藝參數(shù)下，百香果果醋透光率可達85.7%，與原醋相比提高了27%，澄清后的百香果果醋外觀呈淺黃色，色澤透亮清澈，無肉眼可見雜質(zhì)。

關(guān)鍵詞：百香果；果醋；復(fù)合酶澄清劑；響應(yīng)面；透光率

中圖分類號：TS275.4? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0137-06

Abstract： Two enzymes are selected from the four enzymes of protease， amylase， pectinase and glucoamylase， and compounded to clarify the passion fruit vinegar. Taking the light transmittance of passion fruit vinegar as the reference index， the enzymatic hydrolysis process for clarification of passion fruit vinegar is optimized by response surface methodology. The results show that the establishment of response surface model of enzymatic hydrolysis process for clarification of passion fruit vinegar is stable， and the optimum enzymatic hydrolysis process conditions for clarification are as follows： the ratio of compound enzymes （amylase∶pectinase） is 3∶2， the addition amount of compound enzymes is 145 mg/kg， the clarification temperature is 46.5 ℃， and the clarification time is 125 min. Under the optimized process parameters， the light transmittance of passion fruit vinegar can reach 85.7%， which is 27% higher than that of the original vinegar. The clarified passion fruit vinegar has light yellow appearance， bright and clear color， and no visible impurities.

Key words： passion fruit; fruit vinegar; compound enzyme clarifier; response surface; light transmittance

百香果又稱為雞蛋果、巴西果[1]，是西番蓮科西番蓮屬多年生草質(zhì)藤本植物[2-3]，學(xué)名西番蓮，屬于較受歡迎的一種保健養(yǎng)生水果[4-5]。百香果的果肉可以提供人體不可或缺的營養(yǎng)素，如礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)，而且含有豐富的次級代謝產(chǎn)物，其主要成分為黃酮類物質(zhì)[6]。黃酮類物質(zhì)既可以抑制或清除機體內(nèi)過多的游離自由基，又能防止氧化、延緩衰老，使機體持續(xù)保持良好的健康活力狀態(tài)[7]。百香果鮮果水分含量高，成熟后容易腐爛，不適合長期貯存運輸，所以將其加工成果醋是最常見的百香果深加工方式之一。百香果果醋中含有醋酸、生物堿、黃酮、花青素、氨基酸、植物甾醇和維生素等多種生物活性成分，這些成分對促進人體的健康大有益處[8]。由于果醋含有蛋白質(zhì)、高分子碳水化合物和果膠等物質(zhì)，在投放市場期間，隨著運輸和環(huán)境條件的改變，果醋會出現(xiàn)顏色變深暗、反渾等現(xiàn)象，這不僅影響了果醋的外觀和感官體驗[9]，而且在一定程度上影響了果醋的食用價值和市場銷售[10]。

酶澄清法（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、糖化酶）是國內(nèi)外常用于水果加工行業(yè)的澄清方法之一[11]，尤其是在果醋行業(yè)，澄清出的果醋品質(zhì)更好，風(fēng)味更佳。因此，本試驗選用百香果全果為原料進行果醋發(fā)酵，在單因素試驗的基礎(chǔ)上運用響應(yīng)面法對果醋澄清工藝條件進行優(yōu)化，旨在獲得百香果果醋澄清的最佳工藝參數(shù)，并對果醋產(chǎn)品的理化指標和穩(wěn)定性進行測定與研究，探究食品酶制劑對果醋澄清處理的效果，解決因沉淀、渾濁等現(xiàn)象而造成的資源浪費問題。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫皮百香果（原料）：市售；白砂糖：昆明多悅多工貿(mào)有限公司；果酒專用安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；果醋發(fā)酵用菌：煙臺帝伯仕酵母有限公司；纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶：河南萬邦實業(yè)有限公司；測定指標用的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

YS-002多功能破壁養(yǎng)生料理機 深圳市龍華區(qū)金尼熊電器廠；GHP-9050恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；BSA24S電子分析天平 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度計 廣州市愛拓科技有限公司；ATC酒精計 廣東省深圳市啟振儀器有限公司；IS28C pH計 上海儀邁儀器科技有限公司；H1650臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；UV-1601紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 百香果果醋的發(fā)酵澄清工藝流程

新鮮百香果→篩選、清洗→破碎、打漿→纖維素酶、果膠酶酶解→糖酸調(diào)整→裝罐→滅菌→冷卻→酵母活化→接種酵母→酒精發(fā)酵→酒渣分離→粗過濾→果酒→蒸餾水調(diào)節(jié)酒精度→果酒殺菌→冷卻→醋酸菌活化→接種醋酸菌→醋酸發(fā)酵→果醋→過濾、殺菌→加入復(fù)合酶澄清劑→酶解→冷卻離心→測透光率→穩(wěn)定性研究。

1.3.2 操作要點

原料：選擇八成熟、外觀良好無腐爛的新鮮果，本試驗用紫皮百香果。

制備果漿：百香果去柄，沖洗干凈后，按百香果與水的質(zhì)量比為1∶3進行打漿[12]，然后酶解處理的酶用量為果漿質(zhì)量的0.12%，纖維素酶與果膠酶的比例為5∶1，在50 ℃條件下酶解3.5 h。

滅菌：用糖液調(diào)節(jié)初始糖度后65 ℃滅菌0.5 h，冷卻到室溫。

酵母活化：用無菌水溶解酵母后置于32 ℃恒溫水浴鍋中活化0.5 h。

酒精發(fā)酵：酵母活化好后，接種到發(fā)酵液中，置于30 ℃恒溫發(fā)酵箱中恒溫發(fā)酵7 d，發(fā)酵過程中定期排氣。

醋酸發(fā)酵：從發(fā)酵好的果酒中取上清液，用蒸餾水稀釋，調(diào)節(jié)酒精度為8％，糖度為6.5％，稱取一定質(zhì)量的果酒于冷卻殺菌的罐子中，殺菌，冷卻后接種醋酸菌，醋酸菌接種量為8%，用紗布蓋住瓶口，室溫發(fā)酵，每天搖動1～2次，發(fā)酵時間為9 d，過濾，于65 ℃水浴鍋中靜置0.5 h，進行終止發(fā)酵處理，殺菌，冷卻，即得到果醋粗成品。

澄清酶篩選：取果醋粗成品，分別加入蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、糖化酶對果醋進行澄清處理，測透光率，透光率越高表明百香果果醋的澄清效果越好[13]，根據(jù)試驗結(jié)果選出效果較好的兩種酶。

復(fù)合酶澄清：將篩選出的兩種酶進行復(fù)合，探究復(fù)合酶配比、復(fù)合酶添加量、澄清溫度和澄清時間4個因素對透光率的影響。

響應(yīng)面優(yōu)化：根據(jù)得出的單因素試驗結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法研究百香果果醋的酶解澄清工藝。

1.3.3 百香果果醋澄清劑篩選

單一酶澄清劑的篩選見表1。以蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、糖化酶作為澄清劑對百香果果醋進行澄清試驗，酶添加量、澄清溫度、澄清時間均選取各自最適處理工藝，經(jīng)4 000 r/min離心15 min后，取澄清液，在750 nm處測透光率，做3組平行試驗取平均值，從中選出2組試驗結(jié)果較好的酶作為復(fù)合酶澄清劑進行下一步的試驗。

1.3.4 復(fù)合酶澄清條件優(yōu)化單因素試驗

根據(jù)百香果果醋澄清劑篩選的結(jié)果，選出對透光率影響較大的兩種酶進行復(fù)合酶澄清試驗，對果醋進行澄清處理，探究復(fù)合酶配比、復(fù)合酶添加量、澄清溫度和澄清時間4個因素對澄清效果的影響。

1.3.4.1 復(fù)合酶配比篩選

復(fù)合酶配比（質(zhì)量比）按混合比1∶3、1∶2、3∶2、2∶1、3∶1，總添加量為150 mg/kg加入到一定量的百香果果醋中混合均勻，在40 ℃下恒溫水浴酶解90 min，澄清結(jié)束后進行滅酶，冷卻后4 000 r/min 離心15 min，取澄清液在750 nm處測其透光率，確定復(fù)合酶澄清劑最佳配比。

1.3.4.2 復(fù)合酶添加量

以復(fù)合酶配比3∶2，復(fù)合酶添加量按照90，120，150，180，210 mg/kg加入到一定量的果醋中，使其充分混合，在40 ℃下恒溫水浴酶解90 min，澄清結(jié)束后進行滅酶，冷卻離心，取澄清液測其透光率，確定最佳復(fù)合酶添加量。

1.3.4.3 澄清溫度

以復(fù)合酶配比3∶2，總添加量150 mg/kg加入到一定量的果醋中混合均勻，分別在30，35，40，45，50 ℃下恒溫水浴酶解90 min，澄清結(jié)束后進行滅酶，冷卻離心，取澄清液測其透光率，確定最佳澄清溫度。

1.3.4.4 澄清時間

以復(fù)合酶配比3∶2，總添加量150 mg/kg加入到一定量的果醋中混合均勻，在45 ℃恒溫水浴酶解30，60，90，120，150 min，澄清結(jié)束后進行滅酶，冷卻離心，取澄清液測其透光率，確定最佳澄清時間。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

采用Box-Behnken試驗設(shè)計進一步優(yōu)化單因素的取值和交互作用對響應(yīng)值的影響，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以復(fù)合酶配比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、澄清溫度（C）和澄清時間（D）為自變量，以百香果果醋的透光率（Y）為響應(yīng)值，探究果醋澄清的最優(yōu)工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素和水平見表2。

1.4 穩(wěn)定性研究

碘試驗：取澄清后的果醋5 mL，加入10 g/L的碘液1 mL，混合均勻后，觀察醋體顏色是否變藍；醇試驗：取澄清后的果醋5 mL，加入95%的乙醇10 mL，混合，靜置2 d，觀察醋體中是否有絮狀物或沉淀形成；熱處理：取澄清液50 mL，置于55 ℃水浴鍋中0.5 h，取出后迅速放入冷水中冷卻1 h，室溫靜置2 h和7 d，測其透光率。

1.5 理化指標檢測

可溶性固形物含量采用數(shù)顯糖度計測定，總酸含量采用GB/T 12456－2008《食品中總酸的測定》測定，氨基酸態(tài)氮采用GB/T 12143－2008《飲料通用分析方法》測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用WPS Office自帶的軟件進行繪圖處理以及使用Design-Expert 12軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果果醋澄清劑篩選

由圖1可知，4種酶均對百香果果醋澄清有一定的澄清效果，試驗2號、試驗3號的效果最好，即淀粉酶、果膠酶對果醋的澄清效果最好，透光率分別為80.3%、79.8%；試驗1號的效果最差，即蛋白酶對果醋的澄清效果最差，透光率僅為66.5%，所以選擇淀粉酶和果膠酶作為復(fù)合酶對果醋進行澄清處理。

2.2 復(fù)合酶澄清劑對百香果果醋澄清效果影響的單因素試驗

2.2.1 不同復(fù)合酶澄清劑配比對澄清效果的影響

由圖2可知，當(dāng)復(fù)合酶配比（淀粉酶∶果膠酶）在1∶3～3∶2之間時，果醋的透光率隨著配比的增大而增大，比例超過3∶2時，透光率逐漸下降，即在3∶2時達到最大值，為80.6%。說明適宜的復(fù)合酶配比對果醋的澄清有較好的作用效果，但隨著復(fù)合酶配比的繼續(xù)增大，透光率出現(xiàn)逐漸下降的趨勢，原因可能是復(fù)合酶配比的增大使復(fù)合酶在較短的時間內(nèi)達到了酶分子之前的平衡點，而當(dāng)超過這個平衡點時，酶分子與酶分子之間不同電荷的渾濁物互相干擾，破壞了其互補效果，造成透光率下降，澄清效果不佳，根據(jù)結(jié)果選擇復(fù)合酶配比為3∶2。

2.2.2 復(fù)合酶添加量對澄清效果的影響

由圖3可知，復(fù)合酶添加量低于150 mg/kg時，果醋的透光率緩慢上升，當(dāng)復(fù)合酶添加量為150 mg/kg時，果醋的透光率達79.9%，為最大值。當(dāng)添加量高于150 mg/kg后，復(fù)合酶澄清的吸附能力過飽和，相應(yīng)底物被完全水解后，導(dǎo)致酶蛋白殘留過多，使果醋開始出現(xiàn)渾濁，膠體物質(zhì)被部分沉淀，殘留的復(fù)合酶在醋體中懸浮，因而使果醋產(chǎn)生渾濁，因此選擇復(fù)合酶添加量為150 mg/kg。

2.2.3 澄清溫度對澄清效果的影響

由圖4可知，隨著澄清溫度的提高，透光率也相應(yīng)增大，當(dāng)澄清溫度為45? ℃時，透光率達最大值，為84.6%，說明適宜的溫度能提高酶的活性，使反應(yīng)速度加快，進一步促進酶的作用，但溫度大于45 ℃后，澄清溫度超出一定的范圍，即溫度過高，酶會發(fā)生變性，導(dǎo)致酶活力喪失，造成果醋中含有的可溶性物質(zhì)穩(wěn)定性降低，從而使果醋出現(xiàn)渾濁，根據(jù)試驗結(jié)果選擇澄清溫度為45 ℃。

2.2.4 澄清時間對澄清效果的影響

由圖5可知，澄清時間在30～120 min范圍內(nèi)，隨著澄清時間的遞增，果醋的透光率也相應(yīng)升高，當(dāng)酶解時間為120 min時，透光率為81.7%，達到頂點。當(dāng)澄清時間高于120 min后，透光率下降，這是因為酶解時間過長，導(dǎo)致部分酶失活，也有可能是復(fù)合酶與醋體中含有各類物質(zhì)如酸類、醇類等發(fā)生一系列靜電、沉降、分解等作用，導(dǎo)致其他懸浮顆粒沉淀下來，透光率隨之下降，根據(jù)試驗結(jié)果選擇澄清時間為120 min。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合澄清條件

在復(fù)合酶澄清劑對百香果果醋進行澄清處理單因素試驗的基礎(chǔ)上，以復(fù)合酶配比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、澄清溫度（C）和澄清時間（D）為自變量，以百香果果醋的透光率（Y）為響應(yīng)值，研究自變量及各因素間的交互作用對百香果果醋澄清效果的影響。百香果果醋響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3。

采用 Design-Expert 12軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸方程擬合，獲得回歸方程：

Y=85.52+0.52A-0.83B+0.97C+0.84D-0.35AB+0.05AD+0.25BC+0.78BD-0.6CD-1.26A2-2.28B2-1.36C2-1.58D2。

為了檢驗方程的可行性，對百香果果醋透光率的模擬方程進行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，果醋透光率模型的P值<0.000 1，表明回歸模型具有極顯著性（P＜0.01），失擬項的P值為0.180 9，不顯著，可得出試驗所得模型可靠，具有較好的擬合性[14]。

模型的R2為0.952 8，決定系數(shù)RAdj2=0.905 6，證明該模型可以反映各因素之間的關(guān)系，擬合程度較高，試驗誤差小，可以很好地反映實際值，可以對百香果果醋澄清酶解的條件進行分析和預(yù)測。模擬項的A、B、C、D、A2、B2、C2、D2具有極顯著性（P＜0.01），BD、CD達到顯著性效果（P＜0.05），AB、AC、AD、BC對響應(yīng)值的影響均不顯著。F值越大，表明該因素對百香果果醋澄清效果的影響越顯著[15]，由分析可得影響響應(yīng)值的因素順序由大到小為C（澄清溫度）＞D（澄清時間）＞B（復(fù)合酶添加量）＞A（復(fù)合酶配比）。結(jié)果表明，澄清溫度對果醋透光率的影響最大，澄清時間和復(fù)合酶添加量的影響次之，復(fù)合酶配比對果醋透光率的影響最小。

2.3.2 因素交互作用分析

RSM（響應(yīng)面）模型能夠直觀、準確地描述兩個因素之間的相互作用，表現(xiàn)不同因素對某一指標的影響。復(fù)合酶配比、復(fù)合酶添加量、澄清溫度、澄清時間對果醋透光率的交互作用見圖6。每兩個因素在一個拋物線關(guān)系中相互影響，并且只有一個最優(yōu)的RSM值。

由圖6 可知，響應(yīng)面圖開口均向下，響應(yīng)值隨著因素水平的變化先增大，達到極點后開始逐漸減小，響應(yīng)面具有最高點，證明該模型在此水平取值范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點。曲面彎曲的程度則說明單因素對響應(yīng)值的影響是否顯著，曲面越彎曲即坡度越陡，等高線呈橢圓形則影響越大，反之則影響不大[16]。圖6中BD、CD兩組澄清條件的交互作用顯著，等高線圖接近橢圓形，曲面斜率陡峭，說明兩因素的交互作用對透光率的影響具有顯著性；而AB、AC、AD、BC 4組澄清條件兩兩交互作用不明顯，等高線圖趨于圓形，即對果醋透光率的影響不大，這與表4中結(jié)果相吻合。

2.3.3 百香果果醋最佳澄清效果的條件驗證試驗

采用Design-Expert 12軟件對數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，復(fù)合酶澄清的最佳工藝參數(shù)：復(fù)合酶配比為3∶2，復(fù)合酶添加量為145.4 mg/kg，澄清溫度為46.5 ℃，澄清時間為125.3 min，在最佳工藝條件下的百香果果醋透光率預(yù)測值為85.9%。為檢驗其是否合理，需進行試驗驗證，取復(fù)合酶配比 3∶2、復(fù)合酶添加量145 mg/kg、澄清溫度46.5 ℃、澄清時間125 min進行驗證，重復(fù)驗證3次，取透光率平均值，得到百香果果醋透光率為85.7%。預(yù)測值與實測值吻合較好，表明模型方程可用于預(yù)測最優(yōu)響應(yīng)值。

2.4 穩(wěn)定性研究

原醋與澄清醋做碘試驗均不變色，不出現(xiàn)藍色，原因可能是果醋本身雖含少量淀粉，但經(jīng)過靜置或澄清劑處理后可沉淀出淀粉。原醋與澄清醋經(jīng)醇試驗檢驗，原醋沉淀比較多，澄清醋沉淀較少，表明復(fù)合酶能有效地澄清百香果果醋。對澄清后的果醋進行熱處理，使其因加熱引起蛋白質(zhì)變性而沉淀出來，并將加熱后的果醋迅速放入冰水中冷卻，以除去不穩(wěn)定的膠體、沉淀物等，增強果醋的穩(wěn)定性。試驗結(jié)果表明，澄清醋熱處理后放置2 h和7 d，透光率基本不變，雖略微上升，但上升幅度很小，說明經(jīng)復(fù)合酶處理后的果醋穩(wěn)定性較好，見表5。

2.5 理化指標

氨基酸態(tài)氮為0.16 g/dL；總酸（以醋酸計）為4.2 g/dL；可溶性固形物為3.0 °Brix。

3 結(jié)論

本試驗以百香果全果為原料發(fā)酵制備果醋，以透光率為響應(yīng)值，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗確定果醋澄清的最佳工藝參數(shù)：復(fù)合酶配比為3∶2，復(fù)合酶添加量為145 mg/kg，澄清溫度為46.5 ℃，澄清時間為125 min。在此最優(yōu)工藝條件下，澄清后的果醋透光率達到85.7%。澄清處理后獲得的百香果果醋飲品顏色呈淺黃色，醋液體均勻透亮，無肉眼可見雜質(zhì)。

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