紫蘇風味醋的制備及抗氧化活性研究

李孟昊 趙亞娜 李會珍 葉童妹 張志軍

摘要：采用響應面法確定了紫蘇風味醋最佳醋浴工藝條件，并對紫蘇風味醋中主要基本成分與抗氧化活性進行了評價。研究液料比、提取溫度、提取時間3個因素對紫蘇葉多酚得率的影響，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心組合設計和響應面法確定最佳醋浴工藝條件，建立二次多項式擬合方程。采用高效液相色譜（HPLC）對紫蘇風味醋中多酚組分進行定性分析，并對兩種食醋的基本理化性質和體外對自由基的清除能力進行評價。結果表明紫蘇風味醋最佳制備工藝為液料比32∶1（mL/g）、提取時間3.2 h、提取溫度72.6 ℃，在此條件下多酚得率為40.83 mg/g；紫蘇風味醋中的總多酚、總黃酮、總多糖含量均高于原醋，HPLC分析顯示紫蘇風味醋具有紫蘇植株特有的酚酸組分咖啡酸；體外抗氧化性試驗顯示，紫蘇風味醋對DPPH·、ABTS·、·OH的清除能力和對Fe3+的還原能力均強于原醋。

關鍵詞：紫蘇葉；食醋；多酚；成分分析；抗氧化性

中圖分類號：TS264.22? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0029-08

Abstract： Response surface methodology is used to determine the optimal vinegar bath process conditions of perilla flavor vinegar and the main basic components and antioxidant activity of perilla flavor vinegar are evaluated.The effects of three factors including liquid-solid ratio， extraction temperature and extraction time on the extraction yield of perilla leaf polyphenols are studied. Based on single factor test， the optimal vinegar bath process conditions are determined by Box-Behnken central composite design and response surface methodology， and quadratic polynomial fitting equation is established.High performance liquid chromatography （HPLC） is used to qualitatively analyze the polyphenol components in perilla flavor vinegar， and the basic physical and chemical properties of the two kinds of vinegar and their scavenging ability on free radicals in vitro are evaluated. The results show that the optimal preparation process of perilla flavor vinegar is liquid-solid ratio of 32∶1 （mL/g）， extraction time of 3.2 h， extraction temperature of 72.6 ℃. Under these conditions， the yield of polyphenols is 40.83 mg/g.The content of total polyphenols， total flavonoids and total polysaccharides of perilla flavor vinegar is all higher than that of original vinegar. HPLC analysis shows that perilla flavor vinegar has the unique phenolic acid component caffeic acid of perilla plant. In vitro antioxidant test shows that perilla flavor vinegar is stronger than the original vinegar in DPPH· scavenging activity， ABTS·scavenging activity， ·OH scavenging activity and Fe3+ reducing power.

Key words： perilla leaves; vinegar; polyphenols; component analysis; antioxidant activity

紫蘇（Perilla frutescens L.）為唇形科、紫蘇屬一年生草本植物，在2019年被列為藥食同源植物[1]。據(jù)《中國藥典》記載，紫蘇用于治療風寒感冒、咳嗽嘔吐、魚蟹中毒等癥狀[2]。然而，目前人們更重視紫蘇的生物活性。紫蘇中含有多種酚類組分，如迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、木犀草素、芹菜素，其在抗氧化、抗炎、抗過敏、抑菌、抗疲勞和抗癌等方面具有顯著功效[3-5]。任志清等[6]報道紫蘇葉中酚類物質體外對DPPH·、ABTS·具有顯著清除活性，對大腸桿菌等細菌具有抑菌特性，Brautigan等[7]報道咖啡酸可以抑制人肝癌細胞的增殖。

山西老陳醋主要是由高粱、玉米、小麥、麩皮、稻殼等谷物經(jīng)蒸煮、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏醅、淋醋、陳釀等工序發(fā)酵生產(chǎn)而成[8]。食醋中含有多種活性成分，如游離氨基酸、糖、有機酸、多酚等[9-10]。隨著人們健康意識的不斷提升，人們對食醋的需求已不再局限于調酸味、防腐殺菌和增進食欲等功能，而是把目標更多地投向抗衰老、抗癌、抗氧化、防止現(xiàn)代“文明病”等保健功能上。因此，各類保健醋的研發(fā)成為熱點，一類是以植物或水果原料作為輔料，經(jīng)發(fā)酵制成沙棘果醋[11]等；另一類是將植物提取液與食醋按一定比例混合制備的調配型食醋，如蘆薈蘋果保健醋[12]等。

紫蘇具有特殊風味，且在解蝦蟹毒方面功效顯著，但目前國內外關于紫蘇類型的保健醋研究較少。因此，本研究以紫蘇葉為原料，采用醋浴浸提法制備紫蘇風味醋，并對其主要成分和功能特性進行了研究。本研究可以彌補紫蘇產(chǎn)品在食用醋方面的空白，為后續(xù)研究提供了理論基礎，也可為紫蘇風味醋的工藝化生產(chǎn)提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

紫蘇：種植于中北大學試驗田；食醋：山西陳世家釀業(yè)有限責任公司。

1.1.2 試劑

無水Na2CO3、30%H2O2、FeCl3：天津市恒興化學試劑制造有限公司；福林酚：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸：福晨（天津）化學試劑有限公司；DPPH：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS、水楊酸：北京索萊寶科技有限公司；過硫酸鉀、TPTZ、蘆丁、咖啡酸：阿拉丁試劑（上海）有限公司；FeSO4、NaNO2：天津市北辰方正試劑廠；迷迭香酸：成都普菲德生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

2500Y多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；CTL550湘立離心機；USA HZ & HUAZHI分析天平；V-1200可見光光度計；ZYCGF-III-20T超純水制造系統(tǒng) 四川卓越水處理設備有限公司；BioTek Synergy LX 酶標儀；Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國熱電公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇風味醋制備

將新鮮陰干的紫蘇葉粉碎過80目篩得紫蘇葉粉末。準確稱取1.00 g紫蘇葉粉，按一定液料比加醋液，在恒溫水浴鍋中浸提一定時間，浸提結束后趁熱以4 000 r/min離心，時間10 min，最后過濾即得紫蘇風味醋。

1.2.2 多酚含量測定

采用福林酚法[13]測定多酚含量：將醋液稀釋10倍，取100 μL稀釋醋液，加900 μL蒸餾水，加200 μL福林酚溶液，充分混勻，靜置反應1 min，再加1.6 mL 10% Na2CO3溶液，加蒸餾水至5 mL，充分混勻再避光處理2 h，在760 nm處測吸光度值。以沒食子酸為標準品制作多酚標準曲線。紫蘇葉多酚得率的計算如下：

多酚得率（mg/g）=100×C×Vm。

式中：C為醋液稀釋后溶液多酚濃度，mg/mL；V為醋液體積，mL；m為紫蘇葉粉末質量，g。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 提取時間對紫蘇葉多酚得率的影響

取1.00 g紫蘇葉粉末，加20 mL食醋，充分混勻，60 ℃水浴浸提，浸提時間分別為1，2，3，4，5 h，浸提結束后趁熱以4 000 r/min 離心，時間10 min，離心過濾即得紫蘇風味醋，采用福林酚法測紫蘇風味醋中多酚含量。

1.2.3.2 液料比對紫蘇葉多酚得率的影響

取1.00 g紫蘇葉粉末，按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入食醋，充分混勻，60 ℃水浴3 h，浸提結束后趁熱以4 000 r/min 離心，時間10 min，離心過濾即得紫蘇風味醋，采用福林酚法測紫蘇風味醋中多酚含量。

1.2.3.3 提取溫度對紫蘇葉多酚得率的影響

取1.00 g紫蘇葉粉末，加30 mL食醋，充分混勻，分別在40，50，60，70，80 ℃不同溫度下水浴浸提3 h，浸提結束后趁熱以4 000 r/min 離心，時間10 min，離心過濾即得紫蘇風味醋，采用福林酚法測紫蘇風味醋中多酚含量。

1.2.4 響應面優(yōu)化設計

借助Design Expert 8.0 軟件，選擇液料比、提取溫度、提取時間作為試驗因素，設計三因素三水平的優(yōu)化設計，選擇紫蘇多酚得率為響應面指標，進行實驗和數(shù)據(jù)分析，確定最佳提取工藝條件。

1.2.5 最優(yōu)條件驗證

為了考察最優(yōu)條件的穩(wěn)定性與可靠性，需要在最優(yōu)工藝條件下重新進行3次重復試驗進行驗證。

1.2.6 基本理化性質測定

總酸含量：GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；還原糖含量：GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》；氨基酸態(tài)氮含量：GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》。

1.2.7 活性成分測定

1.2.7.1 總黃酮含量測定

參考文獻[14]，將醋液稀釋10倍，取1 mL稀釋醋液于試管中，加水4 mL，加300 μL 5%亞硝酸鈉，混勻靜置6 min，加300 μL 10%硝酸鋁，混勻放置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉，最后加400 μL水定容至10 mL，充分混勻后放置15 min，在510 nm處測其吸光度。以蘆丁為標準品制作標準曲線。

1.2.7.2 迷迭香酸含量測定

參考文獻[15]，量取4 mL 0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH 6）于試管中，加入30 μL 0.2 mol/L的硫酸亞鐵溶液，混勻后加200 μL醋液，最后加770 μL去離子水，充分混勻后遮光處理6 min，在568 nm處檢測吸光度，以迷迭香酸標準品制作標準曲線。

1.2.7.3 總多糖含量測定

參考文獻[16]，將醋液稀釋40倍，取100 μL稀釋液于試管中，加1.9 mL水，加1 mL 5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，混勻后靜置10 min，最后沸水浴15 min，冷卻后于490 nm處測其吸光度，以葡萄糖標準品制作標準曲線。

1.2.8 紫蘇風味醋多酚HPLC分析

醋樣處理[17]：取15 mL醋液，用冷凍干燥機將其凍干成粉末，用50 mL 100%酒精超聲提取5次去除不易溶于酒精的黑素，合并提取物，在35 ℃下旋轉干燥，將殘渣溶解在5 mL蒸餾水中，再用15 mL乙酸乙酯重新萃取3次并合并，將乙酸乙酯在35 ℃下旋轉蒸發(fā)，并將殘渣溶解在含40%甲醇的水中，最后將樣品用0.22 μm有機濾膜過濾。

色譜條件：色譜柱：Hypersil GOLD柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相A：乙酸 ∶乙腈為2∶98，流動相B：乙酸∶水為2∶98；梯度洗脫等其余條件參考文獻[17]：流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm。

1.2.9 抗氧化活性測定

1.2.9.1 DPPH·清除率測定

參考文獻[18]，將醋液稀釋50倍，取1 mL稀釋醋液與4.00 mL DPPH溶液充分混勻，30 min遮光處理，在517 nm處記錄吸光度Ai。Aj為4.00 mL無水乙醇取代4.00 mL DPPH在同一條件下測定的吸光度。A0為用1.00 mL無水乙醇取代1.00 mL樣品溶液在同一條件下測定的吸光度。以原醋為對照，DPPH·清除率按下式計算：

DPPH·清除率%=（1－Ai－AjA0）×100。

1.2.9.2 ABTS·清除率測定

參考文獻[19]，將醋液稀釋40倍，取500 μL樣品稀釋液與5.00 mL ABTS·工作液充分混勻，6 min遮光處理，在734 nm處記錄吸光度Ai。A0為用1.00 mL 70%乙醇取代樣品溶液，其余相同條件下測定吸光度。Aj為用5.00 mL 70%乙醇代替ABTS·工作液，其余條件不變下測定的吸光度，以原醋為對照。ABTS·清除率計算公式為：

ABTS·清除率%=（1－Ai－AjA0）×100。

1.2.9.3 ·OH清除率測定

參考文獻[20]，在10 mL離心管中依次加入9 mmol/L FeSO4 0.6 mL、9 mmol/L乙醇水楊酸 0.6 mL、2 mL稀釋10倍的樣品溶液、2.8 mL水，最后加0.6 mL 8.8 mmol/L H2O2，加400 μL水并充分混勻，于37 ℃水浴，反應15 min取出，測其吸光度Ai，Aj為不加雙氧水的體系，A0為在Ai基礎上不加樣品溶液。以原醋為對照，·OH清除活性計算如下：

·OH清除率%=（1－Ai－AjA0）×100。

1.2.9.4 FRAP試驗

參考文獻[21]，將10 mmol/L TPTZ 溶液、20 mmol/L FeCl3溶液與0.3 mmol/L醋酸緩沖液按1∶1∶10的比例混合制成FRAP工作液。在稀釋40倍的200 μL樣品溶液中加入2 mL FRAP工作液，充分混勻后于37 ℃孵育5 min，然后在593 nm處用酶標儀測其吸光度，以原醋作為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文試驗均進行3次重復，結果以“平均值+標準差”表示。采用Design Expert 8.0軟件進行試驗設計及響應面分析。試驗數(shù)據(jù)首先采用Office Excel 2016軟件進行整理匯總，再用IBM SPSS 26軟件進行顯著性分析，運用Origin 2018軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同提取時間對紫蘇葉多酚得率的影響

由圖1可知，在1～3 h，多酚得率隨時間的增加而增加，在3 h時達到最大值，之后多酚得率隨時間的增加而減少?？赡苁怯捎跁r間短，反應不充分，多酚溶出少，而時間太長導致其他物質大量溶出，且隨著時間的延長，多酚破壞越嚴重[22]，所以最適提取時間為3 h。

2.1.2 不同液料比對紫蘇葉多酚得率的影響

由圖2可知，在液料比10∶1～30∶1 （mL/g）時，多酚得率隨液料比的增加而增加，在30∶1（mL/g）時，多酚得率達到最大值，液料比再次增加，多酚得率反而減少。這可能是因為醋液體積過少，不能充分溶解紫蘇粉末，醋液體積過大，會使整個提取體系的傳熱不均勻和傳質變差，而過多醋液也會使半纖維素、葉綠素、多糖等其他成分在醋液中的溶出量增多[23]，所以最適液料比為30∶1 （mL/g）。

2.1.3 不同提取溫度對紫蘇葉多酚得率的影響

由圖3可知，在40～70 ℃之間，隨著溫度逐漸增高，醋液中分子間的熱運動逐漸加劇，有利于多酚提取，所以得率逐漸增加。在70～80 ℃之間，當溫度很高時，高溫會破壞部分多酚結構[24]，多酚得率下降，所以最適提取溫度為70 ℃。

2.2 紫蘇多酚提取工藝條件響應面法優(yōu)化分析

2.2.1 優(yōu)化設計與結果

對紫蘇多酚得率的提取工藝進行條件優(yōu)化，選取液料比、提取時間、提取溫度3個因素為對象，進行三因素三水平響應面設計，響應面設計優(yōu)化對象和水平編碼值見表1，響應面分析的試驗條件和試驗結果見表2。

對試驗結果進行分析，得到紫蘇多酚得率與試驗因素之間的擬合二次方程：得率=－138.907 50+1.324 82A+16.943 25B+3.629 80C+0.035 500AB+3.725 0×10-3AC－0.033 250BC－0.026 445A2－2.404 50B2－0.025 070C2。

2.2.2 響應面方差分析

由表3可知，失擬項不顯著，模型項顯著，表示該模型構建成功。模型決定系數(shù)R2=0.962 0，表明模擬與實際試驗擬合較好。A、B、C、A2、B2、C2對紫蘇多酚得率影響顯著，而AB、AC、BC對紫蘇多酚得率影響不顯著，3個試驗因素（A為液料比；B為提取時間；C為提取溫度）對紫蘇多酚得率影響的主次順序為C>B>A。

2.2.3 響應面分析

響應面圖和等高線圖可以幫助研究因素及其交互作用對紫蘇多酚得率的影響。響應面圖中試驗因素對多酚得率影響越大，則響應面圖中的曲線越彎曲，等高線中若研究因素之間不存在交互作用，則等高線呈圓形，反之則呈橢圓形[16]。各因素交互作用對紫蘇葉多酚得率的影響見圖4～圖6。

由圖4可知，液料比與提取時間之間不存在顯著交互作用，由圖5可知，液料比與提取溫度之間不存在顯著交互作用，由圖6可知，提取時間與提取溫度之間不存在顯著交互作用。由響應面分析得出最優(yōu)條件：液料比32.35∶1（mL/g），提取時間3.26 h，提取溫度72.63 ℃。

2.2.4 響應面分析法預測值的驗證

在最優(yōu)提取工藝條件下進行 3 組平行試驗，驗證最優(yōu)提取工藝條件的可靠性和穩(wěn)定性。由響應面分析法得到最優(yōu)提取工藝條件：液料比32.35∶1（mL/g），提取時間3.26 h，提取溫度72.63 ℃。將上述條件改為液料比32∶1（mL/g），提取時間3.2 h，提取溫度72.6 ℃，在此條件下重新進行試驗，得到紫蘇多酚得率為40.83 mg/g，與模型預測誤差為2.6%，說明該模型具有可靠性。

2.3 成分測定

由表4可知，與原醋相比，紫蘇風味醋中還原糖、氨基酸態(tài)氮含量與原醋無顯著差別（P>0.05），但總酸含量比原醋極顯著降低（P<0.01），這可能是由于加熱過程中酸性物質部分降解；在活性成分方面，紫蘇風味醋總多酚含量、總黃酮含量、迷迭香酸含量、總多糖含量顯著高于原醋，這是因為紫蘇葉中的多酚物質、黃酮物質、多糖物質被提取出來，郭曉青等[25]報道紫蘇葉提取物中總黃酮含量達32.51%，多糖含量達9.43%，迷迭香酸含量達22.8%。

2.4 醋中酚類物質HPLC分析

兩種醋的HPLC分析見圖7，在本試驗條件下，兩種醋的主要成分都能得到分離，結合標準品分析，對照保留時間可確定紫蘇風味醋中峰1為咖啡酸，峰2為迷迭香酸，其中咖啡酸是紫蘇風味醋中特有的酚酸，而紫蘇風味醋中的迷迭香酸含量顯著高于原醋，這與代沙等報道的紫蘇葉中主要含有迷迭香酸、咖啡酸、槲皮素、芹菜素相符。

2.5 抗氧化活性能力

2.5.1 DPPH·清除能力

由圖8可知，紫蘇風味醋的DPPH·清除率顯著高于原醋。體積從200～400 μL，原醋與紫蘇風味醋的DPPH·清除率隨體積的增加而增加，但紫蘇風味醋的清除率強于原醋，這是因為紫蘇風味醋多酚含量高于原醋，而多酚對DPPH·具有抑制作用[26]。在400～1 000 μL過程中，原醋的DPPH·清除率隨體積的增加而增加，最終達到93%，紫蘇風味醋的清除率維持在93%，這是因為原醋體積增加，多酚含量也逐漸增加，而紫蘇風味醋在400 μL時，對DPPH·的清除率已達到最大值。

2.5.2 ABTS·清除能力

由圖9可知，紫蘇風味醋的ABTS·清除率顯著高于原醋。體積從50～200 μL，原醋與紫蘇風味醋的ABTS·清除率隨體積的增加而增加，但紫蘇風味醋的清除率強于原醋，這是因為紫蘇風味醋多酚含量高于原醋，而多酚對ABTS·具有抑制作用[26]。在200～300 μL過程中，原醋對ABTS·的清除率隨體積的增加而增加，最終接近100%，而紫蘇風味醋對ABTS·的清除率維持平衡，這是因為原醋體積增加，多酚含量也增加，而紫蘇風味醋在200 μL時對ABTS·的清除率達到最大值。

2.5.3 ·OH清除能力

由圖10可知，紫蘇風味醋的·OH清除率強于原醋。隨著醋液體積增加，紫蘇風味醋的·OH清除率逐漸增加，在體積為500 μL時，達到平衡，清除率接近100%，同理原醋體積從100～500 μL，原醋的·OH清除率逐漸增加至接近100%，但從100～500 μL，原醋與紫蘇風味醋的·OH清除率逐漸縮小，這可能是因為紫蘇多酚對·OH具有一定的清除作用[25]，紫蘇多酚對·OH的清除率并不與劑量成正比增加。

2.5.4 FRAP試驗

由圖11可知，隨著醋液體積的增加，紫蘇風味醋的OD值和原醋的OD值呈線性關系，且隨著醋液體積的增加，紫蘇風味醋的OD值與原醋的OD值差別越來越大。這主要是因為隨著體積增大，紫蘇風味醋所含紫蘇多酚增加，導致紫蘇風味醋多酚含量比原醋多酚含量越來越多，而紫蘇多酚具有抗氧化性[27]。

3 結論

本研究通過響應面法得到了紫蘇風味醋的最佳制備工藝條件，并對其主要成分、理化性質和功能活性進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)紫蘇風味醋中總多酚、總黃酮、總多糖、迷迭香酸含量高于原醋，并在紫蘇風味醋中鑒定出一種原醋中不存在的物質咖啡酸，同時紫蘇風味醋對DPPH·、ABTS·、·OH的清除能力和對Fe3+的還原能力均強于原醋，說明紫蘇風味醋的抗氧化效果強于原醋。綜上，證明本研究制備的紫蘇風味醋有實際意義，并可為后續(xù)研究提供參考。

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